C/EBP同源蛋白(CHOP)在內質網應激誘導的細胞凋亡中的作用

王占宇，惠慧，郭青龍

(江蘇省南京市鼓樓區童家巷24號中國藥科大學玄武門校區，江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室，江蘇 南京 210009)

0 引言

內質網(ER)是廣泛存在于真核生物中，在蛋白質的合成、修飾和加工起著關鍵作用，負責蛋白質的折疊、裝配和肽鏈的運輸。通常，ER具有強大的動態平衡系統，但是在一些生理和病理狀態(如局部缺血、病毒感染、pH變化等)下，可能會引起內質網應激。內質網應激與多種疾病有關，例如神經退行性疾病、代謝性疾病、局部缺血性疾病和腫瘤等。其中CHOP(C/EBP同源蛋白)是內質網應激介導的細胞凋亡途徑的組成部分之一，在內質網應激中發揮著至關重要的作用。

1 CHOP的結構和特征

CHOP蛋白屬于CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBPs)家族，首次發現于UV輻射和烷基化劑甲磺酸甲酯的研究中[1]。CHOP也被稱為生長阻滯基因、DNA損傷誘導基因153(GADD153)、DNA損傷誘導轉錄本3(DDIT3)和C /EBPζ，是一種29KD的哺乳動物核蛋白。其N端具有轉錄激活功能，C端則為堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結構域[2]。研究表明，CHOP能夠參與調控細胞的增殖、分化及能量代謝。通常，CHOP的表達非常低，但是它可以通過在多種細胞類型中誘導應激的擾動而強烈表達并在細胞核中蓄積[3]。CHOP在內質網應激誘導的細胞凋亡中起著重要作用，因此CHOP也成為越來越多研究人員關注的焦點。

2 CHOP在內質網應激誘導細胞凋亡中的作用

2.1 CHOP的上游調控通路

細胞通過一系列的精準調控來保證蛋白質的正確折疊，然后從內質網中轉運出來執行其各自的功能。當內質網穩態被打破后，內質網中錯誤折疊或未折疊的蛋白質增加并通過內質網膜向細胞核傳遞應急信號，即未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)[4]。在病理狀態或者微生物感染時，發生不可逆的內質網應激，CHOP的表達急劇上調，從而激活細胞凋亡。CHOP表達的主要受三個因素調控：蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇需求酶1(IRE1)和轉錄因子6(ATF6)。

2.1.1 PERK

PERK是在細胞中普遍表達的Ⅰ型跨膜絲氨酸蘇氨酸激酶，具有連接到GRP78的ER腔結構域和胞質結構域。PERK蛋白能夠形成四聚體，從而進一步增加其激酶活性[5-6]。在UPR發生時，PERK從GRP78上解離下來，經過寡聚化和磷酸化后激活。激活后PERK的主要靶點為真核起始因子2α(eIF2α)，能夠使eIF2α上的51位絲氨酸磷酸化[7]。磷酸化的eIF2α會抑制eIF2β，從而降低蛋白質翻譯和折疊速率，使蛋白質總體合成量暫時減少，從而讓細胞重新折疊蛋白質或者降解ER中的未折疊蛋白質。同時，磷酸化的eIF2α選擇性上調ATF4[8]。通常，ATF4的轉錄水平較低，上調后可以參與蛋白質平衡的調節、抗氧化應激和自噬反應相關基因的表達等[9]。重要的是，ATF4和p-eIF2α能夠增加CHOP的轉錄與翻譯。在持續的ER應激期間，ATF4和CHOP會導致細胞周期阻滯和凋亡相關分子相關的基因表達。研究表明，PERK -/-和ATF4 -//細胞和eIF2α(Ser51)敲入細胞在ER應激期間無法誘導CHOP。無論是在體外還是體內，PERK / ATF4 / CHOP信號通路均被認為在誘導細胞凋亡中起關鍵作用[10]。

2.1.2 IRE1

IRE1α由內質網至細胞核信號傳導1(ERN1)基因編碼，在人體細胞中普遍表達。IRE1α可以三種生理形式存在，即在氨基末端腔結構域(NLD)上與GRP78結合的非活性單體形式，以及活性二聚體或多聚體形式[11]。與PERK一樣，IRE1α在結構上相對保守且具有相似的同源結構域，用來進行二聚化和接受UPR信號。GRP78解離后，觸發IRE1α寡聚化，其胞質激酶結構域的激活以及Ser724，Ser726和Ser729殘基的磷酸化[12]。磷酸化后的IRE1α能夠發揮核酸內切酶的作用，將X盒結合蛋白1(XBP1)的mRNA剪接成XBP1的剪接同工型(sXBP1)和含有26個核苷酸的內含子[13]。sXBP1能夠響應ER應激信號，促進伴侶蛋白、折疊酶和ER相關降解(ERAD)組分的轉錄，并調節CHOP的基因表達。IER1α與TNF受體相關因子2(TRAF2)相互作用下，還可以刺激凋亡信號激酶1(ASK1)的的激活，然后通過下游激酶Jun-N末端激酶(JNK)和p38促絲裂原激活的蛋白激酶(p38 MAPK)，從而導致細胞凋亡。在誘導凋亡的研究中，JNK的抑制劑SP600125能夠抑制CHOP的上調，這表明JNK的激活也參與了CHOP的調節[14]。

2.1.3 ATF6

ATF6是一個90KD的II型ER轉膜蛋白，有α和β兩種亞型。兩種亞型在各類組織細胞中均有表達，但是在UPR信號傳導中，ATF6α占主導地位[15]。與IRE1和PERK相似，在沒有ER應激時，GRP78與ATF6結合，ATF6處于非活性形式。當接收到ER應激信號后，GRP78與ATF6之間的二硫鍵斷開，ATF6以COPII依賴性方式轉移到高爾基體，并被高爾基體上的Site-1蛋白酶(S1P)和Site-2蛋白酶(S2P)切割，產生活性轉錄因子N-ATF6。隨后，活化后的ATF6進入細胞核，誘導ERAD上調CHOP的表達[16]。此外，ATF6還可以激活XBP-1的轉錄，而XBP-1也可以調節CHOP的表達。因此，ATF6可以與XBP-1協同激活CHOP。

在內質網應激三條通路均能夠上調CHOP，但是PERK途徑中ATF4的選擇性上調占據著主導地位。ATF4的翻譯能夠誘導CHOP和其他參與氨基酸代謝、轉運以及氧化還原相關的基因轉錄[17]。下游CHOP中的AARE是CHOP啟動子氨基酸激活的必需基序。雖然ATF2和ATF3可以識別CHOP AARE，但是在ER應激過程中兩者對CHOP的誘導作用尚不明確。

2.2 CHOP的下游調控通路

2.2.1 CHOP通過線粒體依賴性途徑誘導細胞凋亡

多種促凋亡信號作用在線粒體膜上，BCL-2家族蛋白在線粒體膜上形成蛋白質通道，線粒體還能夠釋放凋亡活性物質(如細胞色素C，Smac等)。這些激活了下游的半胱天冬酶家族蛋白并作用于相應的底物，從而引發細胞凋亡[18]。

CHOP作為轉錄因子，能夠調節多種抗凋亡和促凋亡基因的表達，如BCL-2家族蛋白、GADD34、TRB-3和DOCs等。內質網應激作用下，CHOP可以作為轉錄激活因子或阻遏蛋白，通過bZIP結構域與其他C/EBP家族轉錄因子相互作用形成異源二聚體[19]。CHOP能夠下調BCL-2、BCL-XL和MCL-1的表達，上調BIM的表達，并進一步增加BAK、BAX的表達[20]。BAK-BAX寡聚化后，寡聚體經線粒體促進凋亡因子細胞色素C(Cyt-C)和凋亡誘導因子(AIF)的釋放，最終導致細胞死亡[21]。

TRIB3是Tribbles同源蛋白家族成員之一，位于CHOP的下游且受其調控。研究表明，在非心臟細胞缺氧和內質網應激發生時，TRIB3的表達會增加[22]。TRIB3的表達能抑制Akt活性，并且具有促凋亡能力[23]。Akt直接調節caspase-3和caspase-9以及線粒體促凋亡蛋白BAX和BAD的表達。TRIB3也可以通過抑制Akt Ser473和的Thr308位點磷酸化從而抑制Akt的抗凋亡活性[24]。TRIB3表達的上調激活caspase-3，從而增強細胞凋亡。因此CHOP還通過上調TRIB3基因的表達來調節細胞凋亡，直接或間接影響caspase的活性。

2.2.2 CHOP通過死亡受體途徑誘導細胞凋亡

內質網應激也能夠通過外援途徑介導細胞死亡。死亡受體(DR)DR4或DR5與死亡配體(Fas、TNF、TRAIL)結合從而引起細胞凋亡[25]。DR5基因位于8p染色體上，具有兩個剪接變體。PERK-ATF4-CHOP途徑可通過與死亡受體途徑結合并上調死DR4和DR5的表達，而CHOP作為轉錄因子對DR5的表達起著關鍵性的調控作用[26]。在DR5啟動子-276和-264之間具有CHOP的結合位點(+1表示翻譯的起始位點)[27]。此外，ER應激可激活TRAIL-R1/DR4死亡受體。CHOP與磷酸化轉錄因子JUN相互作用形成復合物，該復合物與DR4的啟動子區域結合。CHOP的N末端結構域與磷酸化的JUN相互作用，形成調節DR4和DR5表達的復合物。

研究表明，CHOP-DR5通路會讓癌細胞對活性氧(ROS)介導的外源性凋亡信號敏感[28]。當內質網應激不可逆時，PERK-CHOP功能將持續存在，從而使DR5 mRNA升高。ER和高爾基體中DR5的積累可以驅動死亡受體5(DR5L)的長剪接變體多聚化，DR5L促進死亡誘導信號復合物(DISC)的形成并激活caspase-8[29]。caspase-8的激活還可以促使位于細胞質中的BID裂解為tBID[30]。tBID具有強大的促凋亡活性，并且可以通過BAK和BAX作用于線粒體膜，從而導致Cyt-C釋放。隨后，通過外源和內源性途徑導致凋亡[31]。

2.2.3 CHOP通過其他途徑誘導細胞凋亡

除了通過內源性和外源性途徑介導凋亡外，CHOP還可以通過其他途徑介導凋亡。CHOP能夠增加ER還原酶基因的表達，ER還原酶基因可以催化蛋白二硫鍵異構酶(PDI)氧化，從而導致ER中H2O2產生并進入細胞質，誘導ROS的生成進而導致細胞凋亡和炎癥反應。ER中ROS濃度過高時，會激活IP3R1鈣離子釋放通道，從而使鈣離子進入細胞質[32]。細胞質中的鈣離子通過激活鈣敏感激酶CaMKII(鈣依賴性蛋白激酶)和細胞膜上NADPH氧化酶的亞基NOX2進一步促進ROS釋放，繼而激活CHOP的轉錄，導致細胞凋亡[33]。此外，ROS清除劑可以減弱PERK/eIF2α/CHOP途徑相關蛋白的表達[34]。

GADD34也是CHOP下游的一種促凋亡靶點。GADD34可以促進磷酸化eIF2的去磷酸化，從而恢復蛋白質翻譯。在CHOP-/-細胞中，GADD34表達受損可降低蛋白負荷和內質網應激[35]。

CHOP過度表達會導致細胞周期停滯并導致細胞凋亡。同時，CHOP還可以通過抑制細胞周期調節蛋白p21的表達來引起細胞死亡。p21蛋白不僅抑制細胞周期的G1期，而且與凋亡前因子的活性密切相關[36]。

有研究發現，CHOP通過與FOXO3A和AP-1復合蛋白cJUN相互作用來調節僅含有BH3結構的蛋白表達，從而導致其磷酸化。CHOP的敲低阻止了其下游目標FOXO3a(Thr32)的去磷酸化[37]。

從理論上講，CHOP依賴性細胞凋亡主要是通過直接或間接改變促凋亡或抗凋亡基因的表達來介導的?？偟膩碚f，凋亡途徑是由CHOP的下游靶標介導的。然而，發生這種情況的分子相互作用機理仍有待了解。

3 結論與展望

維持內質網的動態平衡是細胞的重要特性，但是內質網應激也會導致細胞凋亡。當內質網發生過度應激時，細胞啟動凋亡程序，從而觸發細胞死亡。越來越多的研究表明，內質網應激與許多人類疾病的發病機制有關。神經退行性疾病的發病機理可能與蛋白質錯誤折疊息息相關，關鍵功能蛋白的許多突變與CHOP的上調有關，例如內質網應激可能在包括阿爾茨海默病在內的許多疾病的病理生理中起作用[38]。此外，大量證據表明，CHOP依賴的細胞死亡途徑可能與小鼠從心臟肥大到心力衰竭的轉變有關[39]。心肌梗死后大鼠心力衰竭中心肌細胞中CHOP，caspase-12和GRP78的表達下調。在腫瘤微環境中，缺氧、酸性pH、血管形成不良等都是ER應激的激活因子，已經證明CHOP可在ER應激中觸發腫瘤細胞死亡。CHOP誘導的凋亡在病毒或細菌感染期間也起著關鍵作用[40]。但關于CHOP在各種生理和病理條件下的作用，仍有許多問題需要解答。因此，有必要清楚地闡明CHOP誘導的凋亡途徑。