基于高通量測序技術的竹?魚微衛星標記開發與評價

孔嘯蘭，李 敏，陳作志，張 俊，許友偉，江艷娥

（1.農業農村部東海漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部外海漁業開發重點實驗室，廣州 510300）

竹?魚（Trachurus japonicus），隸屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹?魚屬，因其體呈紡錘形，側線上均具高而強的棱鱗，形如用竹板編制的組合隆起?，由此得名，主要分布于我國渤海、黃海、東海、南海，以及日本海域、朝鮮半島海域、西北太平洋溫暖水域，是我國近海海域燈光圍網和拖網的主要捕撈對象，南海近海是竹?魚的主要漁場之一，年捕撈量約為2.5×104t，占全國總量的68%［1-4］。研究表明，東海及福建海域竹?魚資源早已衰退，至今難以恢復［4-7］；南海海域竹?魚雖然產量仍較為穩定，但是也已經被充分利用［4，8］。為了進一步科學管理和合理利用南海區竹?魚資源，急需開展竹?魚資源評估及種群遺傳特性的研究。目前，國內關于竹?魚遺傳方面的研究主要有SONG等［9］、ZHAO等［10］、張艷麗等［11］、牛素芬等［12］采用線粒體和擴增片段長度多態性（AFLP）標記對日本海域、北部灣和福建海域竹?魚遺傳特性的研究，涉及南海海域較少，且未見有關于竹?魚微衛星標記的研究。

微衛星分子標記是共顯性標記，具有多態性高、變異性強、數據易統計等突出優點［13］，被廣泛應用于海洋生物遺傳結構及遺傳多樣性分析［14-15］。但是，由于微衛星標記通用性較差，常常具有極強的種屬特異性。因此，應用微衛星標記開展種群遺傳分析常常需要針對特定物種開發微衛星標記。CHANG 等［16］早期采用構建（CA）n文庫的方法開發出10個竹?魚微衛星標記。文庫構建方法開發微衛星標記工作量大，效率低，難以滿足現今遺傳評估、圖譜構建等需要大批和多樣化的微衛星標記。

因此，本研究通過基于酶切位點的簡化基因組測序技術（restriction-site associated DNA sequence，RAD-seq）開發竹?魚2、3核苷酸微衛星分子標記并對測試群體進行多樣性分析，旨在為竹?魚種群遺傳評估提供技術基礎，以促進其種群資源的評估和管理。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

竹?魚樣品采集于湛江東部海域（111°30′E、20°18′N），共32尾。剪取背部肌肉樣品加入無水乙醇保存。每個樣品剪取少量肌肉組織，使用 “海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒”（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，之后置于-20℃保存備用。

1.2 高通量測序與引物合成

使用Hiseq2000高通量測序儀（Illumina，USA）對竹?魚基因組DNA進行RAD-seq高通量測序（測序服務由廣州基迪奧生物科技有限公司提供），經生物信息學搜索出微衛星位點［17］。使用Premier5.0軟件在重復單元側翼序列上選擇性設計出89條引物，主要參數為：GC含量為40% ～60%，引物長度為18～25 bp，退火溫度為45～60℃，預期擴增長度150～350 bp。送上海英濰捷基貿易有限公司合成引物。

1.3 引物篩選與分型檢測

選取3個樣本混合成的基因組DNA為模板，優化PCR反應條件，對引物進行首輪篩選。PCR反應體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L-1MgCl21.2μL，2 mmol·L-1dNTPs 2μL，正反向引物（10μmol·L-1）各0.8 μL，Taq酶（5 U· μL-1）0.15μL，DNA模版1 μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環，72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測是否能擴增出穩定且均一目的片段。之后分別選取8尾個體的基因組DNA作為模板，對瓊脂糖電泳有穩定且均一目的條帶的引物PCR擴增后聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢測擴增產物多態性。

多態且條帶清晰的引物使用三引物法［18］，利用M13熒光接頭引物進行PCR擴增，并送華大基因公司進行毛細管電泳分型檢測。PCR反應體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5μL，2.5 mmol· L-1MgCl21.2μL，2 mmol· L-1dNTPs 2μL，M13正向引物（10μmol·L-1）0.2 μL，M13反向引物（10μmol·L-1）0.6μL，M13通用熒光引物（10μmol·L-1）0.5μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.15μL，DNA模版1μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，8個循環；72℃延伸30 min。

1.4 群體遺傳學評價

使用32尾竹?魚個體的基因組DNA為模板，對通過篩選的微衛星標記的種群遺傳學特征進行評價。PCR反應體系和條件、等位基因分型方法如上。使用軟件Genepop4.0［19］對每個標記的種群遺傳學特征值進行計算，包括等位基因數（Na）、表觀雜合度（Ho）和期望雜合度（He），進行“哈迪-溫伯格平衡” 檢驗和連鎖不平衡檢測，并對P值進行Bonferroni校正。使用Cervus3.0.7［20］軟件計算多態信息含量（PIC）。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果與微衛星位點分析

RAD-seq高通量測序共獲得竹?魚基因組原始數據1.26 G，GC含量為45.79%，Q20為95.33%，說明測序結果質量較好，可用于后續分析。搜索后共獲得微衛星序列19 920條，2～6核苷酸重復微衛星位點21 912個，其中2核苷酸重復微衛星位點最多，有12 478個，占總數的56.95%，具體見表1。說明2核苷酸重復為主要的微衛星重復類型，其次為3核苷酸重復。

2.2 PCR引物設計和篩選

選取89條2、3核苷酸重復序列設計引物，其中2核苷酸重復為66條，3核苷酸重復為23條。經過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選后，共有27對引物通過篩選（表2），27對引物擴增的序列中21個位點為2核苷酸重復，重復次數為10～13次；6個位點為3核苷酸重復，重復次數為7～9次。

表1 竹?魚基因組中不同類型SSR統計Tab.1 Different types of SSR statistics in T.japonicus genome

2.3 微衛星標記的種群遺傳學評價

使用采集于湛江東部海域的竹?魚群體對篩選合格的微衛星標記進行種群遺傳學評價。如表3，所有27個標記在測試群體中共檢測到265個等位基因，等位基因數分布范圍為3～19，表觀雜合度分布范圍為0.344～0.938，平均為0.654；期望雜合度分布范圍為0.336～0.880，平均為0.729。多態信息含量（PIC）分布范圍為0.318～0.882，平均為0.707，表明開發的微衛星位點具有較高的雜合度。除2個標記外，其他標記等位基因頻率均符合“哈迪-溫伯格”平衡（HWE）。連鎖不平衡檢測表明各位點間無連鎖不平衡現象。

3 討論

3.1 高通量測序發掘微衛星序列的技術優勢

傳統微衛星標記開發方法耗時長、花費高、技術難度大。以磁珠富集法為例，標記開發過程中基因組DNA濃度、接頭連接效率、富集過程中的雜交溫度以及洗脫條件的控制等因素都會影響微衛星篩選的效率［21-22］，且最終獲得的有效微衛星序列僅幾百條［23-24］。相比較而言，高通量測序技術開發微衛星標記，省略了建庫、克隆、篩選等，只需提取基因組DNA測序，利用生物信息學手段可直接獲取微衛星序列，通常是傳統方法獲得微衛星序列數目的幾百倍［25-27］，具有高效、便捷、準確的特點，能夠滿足于短時間內大批量微衛星位點的開發需求，比如連鎖圖譜構建、數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位等［28-29］。同時，傳統的微衛星開發方法獲得的微衛星重復類型基本為2核苷酸重復，而高通量測序技術的發展，更加方便了研究者獲得3、4甚至更多核苷酸重復的微衛星引物［26］。可見，高通量測序技術較傳統微衛星開發的方法更為快速、高效。

本次RAD-seq高通量測序共獲得竹?魚基因組原始數據1.26 G，GC含量45.79%，測序質量Q20為95.33%；共獲得微衛星序列19 920條。說明測序質量穩定高效，并獲得了數量龐大、類型豐富的微衛星序列，可用于后續竹?魚微衛星標記大規模開發和相關遺傳學研究。

3.2 不同核苷酸重復微衛星位點比較

本次高通量測序結果表明在竹?魚微衛星位點中2核苷酸重復為主要重復類型，其中AC/TG類重復數量最為豐富，占41.6%，GC/CG類重復較為少見。此結果與其他水產動物微衛星位點研究結果相一致［30-32］。例如，熊良偉等［31］對中華鳑鲏（Rhodeus sinensis）微衛星的分析中，2核苷酸占總微衛星位點的53.59%，2核苷酸重復中AC/TG類占60.63%；GC/CG類僅占0.32%。在裸體異鰾鰍鮀（Xenophysogobio nudicorpa）中［30］，2核苷酸重復占總微衛星位點比例高達83.15%，AC/GT類重復占49.36%，GC/CG類重復僅有4個。

盡管研究表明開發的微衛星標記以2核苷酸重復為主，仍有學者對3、4核苷酸重復的微衛星標記感興趣。對人類基因組的研究中發現，3核苷酸重復序列與遺傳疾病的發生有關，并且具有較高的多態性和遺傳穩定性［33］。在對水產動物3、4核苷酸重復微衛星標記的篩選中，部分學者的研究結果存在差異。例如，房祖業等［26］對大刺鰍（Mastacembelus armatus）2、3、4核苷酸重復微衛星標記的篩選發現，2核苷酸重復較3、4核苷酸重復具有更高的篩選效率和多態性；而魯翠云等［34］、譚照君等［35］和李文升等［36］的研究認為3、4核苷酸具有更高的多態性和分型效果。本文考慮高通量測序結果中2、3核苷酸重復微衛星位點數已占82%，因此，僅選取2、3核苷酸重復位點進行篩選，結果顯示，2、3核苷酸重復微衛星位點的多態性差異并不明顯。

表2 27對竹?魚微衛星引物信息Tab.2 Information of 27 pairs of primers in T.japonicus

表3 竹?魚微衛星標記的種群遺傳學特征Tab.3 Characteristics of microsatellite loci in T.japonicus

3.3 微衛星標記的種群遺傳學特征

ELLEGREN［37］提出真核生物微衛星位點重復大部分在30次以下，2核苷酸重復以15～19次為主。基于WEBER［38］的研究結果，重復次數高的微衛星在種群中表現出的多態性較高。龔小玲等［39］對澳洲鰻鱺（Anguilla australis）進行標記開發時發現，微衛星重復序列的重復次數過高會影響PCR效果，選擇居中的重復次數為宜。因此，本研究選擇重復次數較為適中的位點，分別為2核苷酸重復10～15次、3核苷酸重復7～9次。

群體雜合度的高低反映了群體在多個基因座上的遺傳變異及群體遺傳多樣性豐富度［36］。本研究中竹?魚群體的平均表觀雜合度為0.654，平均期望雜合度為0.729，說明該群體的遺傳多樣性較高。平均表觀雜合度和期望雜合度存在差異，說明存在雜合子缺失或者純合子過剩的情況。多態信息含量（PIC）也是衡量群體遺傳多樣性的重要指數，研究者BOTSTEIN等［40］認為當基因標記PIC＞0.5時，為高度多態位點；當0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態位點；當PIC＜0.25時，為低度多態性位點，通常不作為遺傳多樣性分析。本文中竹?魚位點有5個為中度多態位點，其他均為高度多態位點。表明開發所得的竹?魚微衛星標記在該群體中具有較好的遺傳穩定性和豐富的遺傳多樣性。

在所有27個位點中有2個位點偏離了 “哈迪-溫伯格”平衡（HWE），近親雜交、無效等位基因、種群退化和自然選擇等因素皆可能導致微衛星位點偏離HWE［25］。另外，有學者研究發現，樣本量小于25時，對平均等位基因數、有效等位基因數及表觀雜合度具有較明顯的影響［41］。本研究中，有效樣本量≥28，表明位點的多樣性參數結果較為可靠。