基于線粒體COI基因序列的智利竹?魚遺傳多樣性分析

刁 樂，宋 煒，魏鴻擎，梁述章，蔣科技，黃洪亮，馬春艷，張鳳英，陳雪忠，馬凌波

（1．中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090；2．上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

智利竹?魚（Trachurus murphyi）屬脊索動物門， 硬 骨 魚 綱 （Osteichthyes）， 鱸 形 目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹?魚屬，為暖水性中上層魚類，是典型的大洋性中上層聚群魚類［1］。智利竹?魚廣泛分布于秘魯和智利沿海水域以及智利專屬經濟區以外的公海海域［2］。其生長快、生產力高且捕撈產量多，是世界上主要的海洋經濟魚類之一［3］。研究者曾利用聲吶模型［4］和捕食營養學［5］等研究智利竹?魚的資源量和分布范圍，20世紀90年代智利竹?魚的資源量可高達440萬t［6］，但隨著高強度商業捕撈的發展，智利竹?魚種群結構遭到嚴重破壞，南太平洋區域漁業管理組織強調，相關機構迫切需要對竹?魚種群結構和資源保護展開更多的追蹤研究［7］，以保證竹?魚良好的種質資源。

迄今為止，對智利竹?魚的研究多集中在資源調查［8］、時空分布變化［9］、攝食營養［10］和生長發育［11］等方面，對其遺傳多樣性和遺傳分化方面的研究較少。張敏等［12］以細胞色素b（Cytb）基因作為分子標記，對智利沿岸（33°S、72°W）、太平洋區域（33°S～35°S、93°W ～95°W）等的智利竹?魚群體做了遺傳關系初步研究。張偉等［13］利用RAPD技術對東南太平洋海域（34°S～37°S、90°W ～110°W）智利竹?魚種群結構進行了研究。CáRDENAS等［14］運用微衛星技術對新西蘭區域（37°S、178°E）、智利沿岸（20°S～39°S、70°W ～75°W）和太平洋區域（32°S、91°W）等的智利竹?魚進行了遺傳關系分析研究。這些研究的采樣區域多集中在智利沿岸和太平洋區域，缺少對智利外海（78°W ～81°W、40°S～44°S）區域智利竹?魚群體的研究。此外，目前利用細胞色素氧化酶亞基I（COI）作為分子標記對智利竹?魚的遺傳多樣性進行分析的研究較少，這使得本研究具有重要意義。

魚類線粒體基因為共價閉合環狀雙鏈DNA分子，結構簡單且遵循母系遺傳，無組織特異性和遺傳重組，因此常被用作分子標記，并廣泛應用于種群遺傳結構和系統進化的研究中［15-17］。COI作為線粒體13個蛋白編碼基因的一員，在分子標記上是研究最為清楚的線粒體基因之一，也有學者認為相比其他線粒體基因，COI是更為理想和常用的分子標記［18］。本研究選用COI為分子標記，檢測COI基因的序列變異，分析不同群體智利竹?魚的遺傳結構，以期為智利竹?魚資源遺傳多樣性和漁業管理提供科學評價和理論指導。

1 材料與方法

1． 1 樣本采集和基因組DNA提取

本研究樣本2014年4—6月采集于智利外海（78°40′W ～81°45′W、40°18′S～44°25′S）水域內，具體分為A、B、C、D、E、F等6個不同采樣點，每個采樣點均采集36個樣本，其采樣站點和地理分布見圖1。采集樣本后取其肌肉組織，利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取樣本總DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性，并用分光光度法測定DNA的濃度和純度，于-20℃保存備用。

1． 2 智利竹?魚mtDNA COI序列擴增及測定

對智利竹?魚mtDNA COI序列采用通用引物［19］（由上海生工生物技術服務有限公司合成），CFF：（TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCA C）和CFR：（ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA）進行PCR擴增。PCR反應體系為50μL，其中包括10×PCR buffer（Mg2+）5．0μL，2．5 mmol·L-1dNTP 4．0 μL，10 μmol· L-1上 下 游 引 物 各2．0μL，5 U· μL-1Taq DNA 聚合酶0．5μL，50 ng·μL-1DNA模板2μL，最后加雙蒸水至總體積為50μL。樣品在Eppendorf PCR儀上進行PCR擴增，反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；循環結束后進行72℃延伸8 min。PCR產物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經成像系統拍照記錄，選擇目的條帶清晰的PCR產物送至上海杰李生物技術有限公司進行雙向測序后拼接，測序引物同為PCR擴增引物。

圖1 采樣站點地理分布圖Fig.1 Geographical distribution of sampling sites

1． 3 數據分析

運用Clustal X對測序所得的216個樣本的COI序列進行拼接及人工校正，將雙向拼接的全序列在NCBI中進行BLASTn同源性分析。利用DnaSP 5．1軟件分析樣本單倍型數目、單倍型多樣性、多態位點數和核苷酸多樣性。使用MEGA 5．1軟件構建單倍型鄰接關系樹，關系樹的可靠性采用1 000次重抽樣進行評估。

使用MEGA 5．1軟件計算其變異位點、簡約信息位點數和堿基含量；分組計算群體內遺傳距離及兩兩群體間遺傳距離，根據Kimura-2-Parameter（K-2-P）模型構建智利竹?魚群體間的UPGMA樹。采用簡化的中介網絡法（medianjoining）［20-21］構建單倍型網絡關系圖來探討單倍型的譜系結構。

利用Arlequin 3．1軟件中的AMOVA計算兩兩群體間的遺傳分化指數、群體內及群體間的遺傳變異分布、遺傳變異指數Fst值，利用1 000次重抽樣分析來檢驗統計學顯著性。關于群體歷史動態研究，利用Arlequin 3．1軟件完成Tajima’ s D檢驗和Fu’s Fs檢驗，來檢測中性假說是否成立，Tajima’s D［22］和Fu’s Fs［23］中性檢驗如果是負值并且顯著偏離中性，則可能是由于群體擴張引起的。利用DnaSP 5進行核苷酸錯配分布（mismatch distribution）分析，檢驗是否存在群體擴張。

2 結果與分析

2． 1 序列特征分析

智利竹?魚所有個體的線粒體COI序列均可被穩定擴增，PCR擴增產物經凝膠電泳，均顯示為一明亮清晰的條帶，大小為650 bp左右，PCR擴增產物經試劑盒純化回收后測序。將測序所得到的序列通過BLAST比對，發現其與GenBank數據庫中的智利竹?魚COI序列（GenBank登錄JQ354519．1）NC_002813．1相似度為99%，經比對和校正，最后用于群體數據分析的COI序列長為624 bp。COI基因序列中，變異位點13個，占總位點數的2．08%；其中簡約性信息位點4個，單變異位點9個；平均堿基含量（%）分別為A（23．4）、T（31．1）、G（18．0）、C（27．5），A+T的含量（54．5）略高于G+C的含量（45．5）。

2． 2 單倍型在群體中的分布及遺傳關系

在216尾智利竹?魚樣本中共檢測到14個單倍型，各樣本的單倍型分布見圖2。9個單倍型為單個群體所獨有，而群體間共享單倍型為5個，占單倍型總數的35．7%，其中Hap1和Hap3為6個群體所共享。Hap1擁有最高的共享率，共135個個體擁有此單倍型，占總數的62．5%。其次為Hap3，其被49個個體共享，共享率為22．7%。Hap10被5個群體的7個個體共享，Hap2被4個群體的11個個體共享。在獨享單倍型中，群體A擁有最多的獨享單倍型，共計4個，分別為Hap4、Hap5、Hap6和Hap8，且為1個個體所擁有。運用所有單倍型構建的鄰接關系樹顯示（圖3），其節點分支支持率普遍偏低，沒有呈現明顯的地理譜系結構。

圖2 智利竹?魚線粒體COI基因序列變異位點Fig.2 Trachurus murphyi mitochondrial COI gene sequence variation sites注：A：腺嘌呤，G：鳥嘌呤，C：胞嘧啶，T：胸腺嘧啶Note：A：adenine，G：guanine，C：cytosine，T：thymine

2． 3 群體遺傳多樣性和遺傳結構

智利竹?魚6個群體的遺傳多樣性分析見表1。從整體水平來看，216個樣本的平均單倍型多樣性為0．550±0．033，平均核苷酸多樣性為0．001 10，單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均比較低。從單倍型多樣性來看，群體A和E的單倍型多樣性較高，群體B、C、D和F的單倍型多樣性較低，其中群體F僅為0．375±0．090。在核苷酸多樣性中，6個群體的核苷酸多樣性均比較低，群體F最低為0．000 63。綜合單倍型多樣性和核苷酸多樣性可見，6個群體普遍擁有較低的遺傳多樣性，其中群體A遺傳多樣性最高，而群體F的遺傳多樣性最低。

分析智利外海6個智利竹?魚群體的遺傳距離，群體內的平均遺傳距離為0．000 63～0．001 70，其中群體F群體內遺傳距離最小（0．000 63）；群體間的平均遺傳距離為0．000 77～0．001 42，群體B和群體F群體間遺傳距離最?。?．000 77）（表2）。由以上結果可見，群體內和群體間的遺傳距離均較小。用Arlequin3．11軟件分析兩兩群體間的遺傳分化指數Fst，結果顯示，兩兩群體間的遺傳分化系數在-0．019 50～0．041 75，統計檢驗均不顯著（P＞0．05），這表明群體間存在高度的遺傳同質性。另外，從基于K-2-P群體間遺傳距離構建的UPGMA樹看，6個群體兩兩先后聚為一支，沒有明顯的遺傳隔離（圖4）。

AMOVA分子方差分析結果見表3，將所有群體作為一個組群分析，群體間的遺傳變異為0．3%，群體內遺傳 變異為99．7%，Fst值為0．002 62，變異主要來源于群體內，且群體間無分化。這些分析表明6個群體之間不存在顯著的遺傳分化。

圖3 智利竹?魚14種單倍型在6個群體中的分布及其分子系統樹Fig.3 Distribution and molecular phylogenetic tree of 14 kinds of haplotypes in 6 Trachurus murphyi populations

表1 不同群體智利竹?魚的遺傳多樣性參數Tab.1 Genetic diversity of different populations of Trachurus murphyi

2． 4 群體歷史動態分析

依據Tajima’s D檢驗和Fu’s Fs檢驗方法對6個智利竹?魚群體線粒體COI基因DNA多樣性信息進行中性檢驗，檢驗結果見表4。Tajima’s D檢驗結果和Fu’s Fs檢驗結果均為負值，Tajima’s D值呈顯著差異，Fu’s Fs檢驗結果呈極顯著差異，推測智利竹?魚在智利外海范圍內經歷過種群擴張事件。

表2 智利竹?魚群體間遺傳距離（對角線上）和遺傳分化系數（F st）（對角線下）Tab.2 Pairwise genetic distances（above diagonal），fixation index（F st）（below diagonal）between every two populations of Trachurus murphyi

圖4 基于K-2-P群體間遺傳距離構建的智利竹?魚6個群體的UPGMA樹Fig.4 UPGMA tree of 6 Trachurus murphyi populations constructed by K-2-P genetic distance

表3 智利竹?魚群體遺傳差異的AMOVA分析Tab.3 Analysis of molecular variance（AMOVA）among populations of Trachurus murphyi

表4 智利竹?魚線粒體COI的中性檢驗和錯配分布Tab.4 Neutrality tests and mismatch distribution of mitochondrial COI gene of Trachurus murphyi

3 討論

3． 1 智利竹?魚群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的核心基礎，其多樣性的高低水平對物種的環境適應力、進化潛能和生存能力至關重要，遺傳多樣性的豐富程度越大表明其對環境的適應能力越強，同樣進化潛能和生存能力也相對較強。相反，遺傳多樣性的下降會導致物種對環境的適應力降低［24-25］。

在對智利竹?魚為數不多的遺傳多樣性研究中，研究者們采用的線粒體基因、微衛星等方法分析得出，智利竹?魚普遍具有較低的遺傳多樣性，并推斷智利竹?魚在南太平洋具有廣闊的分布帶，可視為一個遺傳群體［12-14］。本研究共獲得14個單倍型，群體間共享單倍型為5個。Hap1擁有最高的共享率，共135個個體擁有此單倍型，占總數的62．5%。種群共享及個體共享單倍型占比大，說明智利外海竹?魚間基因交流頻繁。 根 據 LAN 和 SHI［26］及 GRANT 和BOWEN［27］對群體遺傳多樣性的研究表明，當單倍型多樣性小于0．5、核苷酸多樣性小于0．005時，其群體的遺傳多樣性為較低水平。智利外海竹?魚在整個分布范圍內皆擁有較低的單倍型多樣性（0．375～0．716）和核苷酸多樣性（0．000 63～0．001 69），表明其近期出現過或正經歷種群瓶頸效應，或種群由單一、少數系群所發生的奠基者效應，導致其遺傳多樣性偏低，這一結果也驗證了可把該竹?魚分布帶視為一個群體的推斷。GARDENASA等［14］將在南太平洋區域的竹?魚視為一個種群，張敏等［12］認為智利經濟區內、外3個群體不存在顯著遺傳分化，本研究將該智利竹?魚分布帶視為一個群體的推斷可與上述研究相互印證和補充。

一般單倍型多樣性與群體大小和環境相關聯，較大的群體和較大差異的環境會導致群體單倍型多樣性偏高［28］。本研究中群體A出現較高單倍型多樣性，這可能是由智利竹?魚不同季節的空間分布所致，智利竹?魚在冬春季節受西風漂流帶來的冷水勢力影響，整體向北移動［29］，環境因子的變化可能造成遺傳多樣性的變化。同時，智利竹?魚是高度洄游物種，SERRA［30］認為智利竹?魚的洄游軌跡是一個環形的遷移。樣本的隨機采集和樣本數量的限制，也可能會造成結果偏差，因此，需要研究者們對智利竹?魚群體不斷的追蹤調查，以檢測其多樣性的實時變化。

3． 2 智利竹?魚的群體遺傳結構

單倍型構建的鄰接關系樹表明（圖3），單倍型的分支與不同采樣站點的群體之間沒有明顯關聯，AMOVA分析結果顯示，群體間的遺傳變異（0．26%）遠遠小于群體內遺傳變異（99．74%），6個智利竹?魚群體沒有呈現出顯著的系統地理格局。從遺傳距離來看，群體內遺傳距離和群體間遺傳距離都比較小，遺傳分化系數Fst所有數值均小于0．05，且大部分為負值。根據Fst劃分的遺傳分化水平，當Fst＜0．05時，說明群體間無分化；當0．05＜Fst＜0．15時，說明群體間呈低度分化；當Fst＞0．15時，說明群體間呈高度分化［31］。分析結果表明，本研究中6個智利竹?魚群體遺傳分化主要來源于群體內，且群體間無明顯分化，這與張偉等［13］的研究結果一致，即東南太平洋智利竹?魚群體間不存在顯著遺傳分化。

智利外海竹?魚具有季節性洄游的特點，有較強的擴散能力，因此智利竹?魚的分布范圍較廣，同時其在較大的水域內可隨機交配，這導致其產卵區域和仔魚分布也十分廣泛，本研究所采樣本站點屬東南太平洋水域，各群體間無明顯分化，可將其視為一個較大的智利竹?魚群體。何宗會［32］研究表明由于捕撈船隊的大量捕撈和環境因素的變化，造成南太平洋智利竹?魚漁業資源量呈逐漸下降的趨勢。同時受經濟區內智利竹?魚養殖群體等因素影響，可能導致自然選擇多樣性被破壞，使得整個智利竹?魚群體的遺傳多樣性水平較低。為了長遠的維持智利竹?魚種質資源和遺傳豐富度，應科學規范管理、適度適量捕撈，響應南太平洋區域漁業管理組織的積極號召，以保證智利竹?魚群體的生態平衡。