CBX1在胃癌中的表達及與胃癌患者病理特征相關性的生物信息學分析*

吳 爽，張濤元，李 俏，曹三成，祝擷英△

1.西安交通大學附屬西安市兒童醫院檢驗科，陜西西安 710003；2.日照心臟病醫院麻醉科，山東日照 276800

胃癌的惡性程度和病死率均較高，由于胃癌在早期缺乏特異性癥狀，導致其早期診斷率較低[1]。目前已發現許多基因參與了胃癌的發生、發展，但胃癌的發病機制仍未完全被揭示[2]。人類基因組中CBX家族共包含8個基因，均與異染色質、基因表達及生長發育等生物過程密切相關。生物信息學技術分析結果表明CBX1在肝細胞癌、乳腺癌等多種癌癥中發揮重要作用[3]，然而其在胃癌中的作用機制仍不明確。

微陣列技術和生物信息學技術已被廣泛用于鑒定基因組的表達水平，幫助識別與癌癥相關的差異表達基因和相關信號通路[4]。本研究利用生物信息學技術，分析胃癌中CBX1的表達情況，探究CBX1與胃癌患者病理參數和預后的關聯，聚焦其在胃癌中可能參與的生物學過程，提供胃癌早期診斷和預后相關的標志物。

1 材料與方法

1.1CBX1在轉錄水平表達差異的驗證 利用Oncomine數據庫[5]，比較CBX1在胃癌組織與正常胃組織中轉錄水平的表達差異，同時獲取胃癌組織與正常胃組織中CBX1的研究數據，參數設置如下：t檢驗，P=0.01，變化倍數為1.5倍，基因等級為10%，類型為mRNA。利用GEPIA數據庫中腫瘤基因組圖譜與基因表達項目(GTEx)的數據，分析驗證CBX1在正常胃組織與胃癌組織中的轉錄水平的表達差異，參數設置如下：方差分析，|Log2(FC)|最佳臨界值為1.0，q=0.01。

1.2蛋白質印跡法(Western blot)驗證CBX1在正常胃黏膜細胞GSE-1和胃癌細胞SGC7901中的表達差異 兔抗人CBX1(PA5-28448)抗體購自美國Invitrogen Ebioscience公司，GAPDH抗體購自英國Abcom公司。將等量的正常胃黏膜細胞GSE-1及胃癌細胞SGC7901接種于10 cm培養皿，培養48 h以后提取蛋白，檢測濃度后，進行Western blot實驗，以GAPDH為內參，分析兩種細胞中CBX1蛋白表達水平的差異。

1.3免疫組化驗證CBX1在正常胃組織和胃癌組織中的表達差異 在Human Protein Atlas[6]網站(https://www.proteinatlas.org)中，利用免疫組化數據，從蛋白表達水平驗證CBX1在胃癌組織與正常胃組織中的表達差異，所用抗體為HPA031762。

1.4CBX1與胃癌患者臨床病理參數的分析 利用UALCAN數據庫[7]，分析CBX1的mRNA表達情況與胃癌患者的癌癥分期和腫瘤分級之間的相關性。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具，分析CBX1與胃癌患者總生存期(OS)的相關性。依據胃癌患者CBX1表達值的中位數，分為高表達和低表達2組，計算風險比、95%置信區間和相應P值，制作生存曲線。

1.5CBX1關聯基因的篩選及富集分析 使用GEPIA數據庫獲取與CBX1在胃癌中具有相似表達的基因，應用STRING數據庫[8]及Scytoscape[9]軟件，構建并可視化蛋白質互作(PPI)網絡；利用Metascape網站對相似基因進行基因本體(GO)富集分析；利用Starbase網站進行相似基因的京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6統計學處理 使用SPSS22.0統計軟件對數據進行處理分析，各數據的比較采用t檢驗和方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CBX1的mRNA水平在胃癌組織的表達情況 Oncomine數據庫分析顯示：與正常組織比較，CBX1的mRNA水平在大多數腫瘤組織中高表達，見圖1A；其中有6組數據顯示CBX1的mRNA在胃癌組織中高表達，見圖1B、表1。利用GEPIA數據庫對胃癌中CBX1的mRNA表達情況加以驗證，結果表明，CBX1的mRNA在胃癌組織高表達，見圖1C。

表1 不同類型胃癌與正常胃組織CBX1轉錄水平的變化(Oncomine數據庫)

2.2CBX1的Western blot結果 Western blot結果顯示，CBX1在GSE-1細胞中的表達水平低于SGC7901細胞，即CBX1在胃癌細胞中高表達，見圖2。

2.3CBX1的免疫組化結果 免疫組化結果顯示，CBX1在正常胃組織中低表達，胃癌組織中高表達，見圖3。

注：A為CBX1在多種腫瘤中的表達情況；B為6組胃癌數據中CBX1的表達情況；C為CBX1在胃癌組織與正常胃組織中mRNA表達情況。

圖2 CBX1的Western blot結果

注：A為CBX1在正常胃組織中的表達情況；B為CBX1在胃癌組織中的表達情況。

2.4CBX1與胃癌患者病理參數的相關性分析 利用UALCAN數據庫對CBX1進行胃癌患者臨床病理參數相關性分析，結果顯示在腫瘤分級中，正常組織vs.2級胃癌組織(P=1.56E-4)、正常組織vs.3級胃癌組織(P=4.12E-5)、1級胃癌組織vs.3級胃癌組織(P=0.00)的mRNA水平比較，差異有統計學意義，見圖4A；在癌癥分期中，正常組織vs.2期胃癌組織(P=9.98E-5)、正常組織vs.3期胃癌組織(P=5.58E-5)、正常組織vs.4期胃癌組織(P=9.46E-3)、3期胃癌組織vs.4期胃癌組織(P=4.22E-2)的mRNA水平比較，差異有統計學意義，見圖4B。利用Kaplan Meier-Plotter在線分析工具進行CBX1與胃癌患者預后的相關分析，并繪制生存曲線圖，結果顯示：CBX1高表達組患者的生存率遠低于CBX1低表達組，見圖4C。

注：A為CBX1在不同的腫瘤分級中的mRNA相對表達水平；B為CBX1在不同癌癥分期中的mRNA相對表達水平；C為CBX1表達與胃癌患者生存率的關系。

2.5CBX1在胃癌中的相似基因及其PPI網絡構建 利用GEPIA數據庫，在胃癌組織中共獲得與CBX1表達有相似性的基因50個，在STRING網站中這些基因共構建出含有51個點，985條邊的PPI網絡，Cytoscape 的MCODE插件，獲取其中相互作用程度最高的43個點，877條邊組成的核心網絡，見圖5。

圖5 CBX1的PPI可視化結果

2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO富集分析結果顯示，43個基因的生物學功能主要聚集在組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂過程，見6A。KEGG通路富集分析發現，43個基因主要涉及的通路包括核糖體及氨基酸的生物合成途徑，見圖6B。

注：A為GO富集分析圖；B為KEGG通路富集分析圖。

3 討 論

目前，分子生物標志物在疾病的診斷、預后和精準治療中發揮重要的作用。隨著檢測技術和治療手段的提高，胃癌發病率有所下降，但仍是世界范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤[10]。胃癌的危險因素主要包括幽門螺桿菌感染、不當飲食、不潔飲食及吸煙等，而早期診斷的缺乏和腫瘤的轉移、擴散則是其主要致死原因[11]。因此，亟須探索更多的分子標志物用于胃癌的早期診斷和靶向治療。

CBX1參與了染色質結構和基因表達的遺傳調控過程[12]，有研究證實，CBX1能夠在肝癌細胞中高表達，且其高表達與肝癌患者預后不良相關[3]；而在關于垂體瘤的一項研究中發現，高表達的CBX1能夠導致垂體瘤的發生[13]；在前列腺癌中，CBX1高表達與組蛋白H3K3的甲基化密切相關[14]。本研究通過兩組不同來源的數據庫——Oncomine數據庫及GEPIA數據庫，發現CBX1的mRNA水平在胃癌組織中明顯升高，之后利用Western blot和免疫組化實驗發現CBX1蛋白在胃癌細胞SGC7901及胃癌組織中高表達，這些數據表明CBX1的高表達與胃癌有相關性。UALCAN數據庫的臨床數據分析顯示，CBX1的mRNA表達在胃癌的不同分級、分期中均有差異，即隨著腫瘤的發展，CBX1的mRNA水平也隨之升高，預示著CBX1可以作為胃癌早期診斷及癌癥進展的標志物。生存分析結果顯示，CBX1高表達與胃癌患者的生存率相關，風險比高達2.09，提示CBX1可以作為胃癌預后不良的危險因素。通過尋找在胃癌中與CBX1有相似表達的基因，篩選出43個作用緊密的基因集，富集分析顯示，這些基因主要參與組蛋白修飾、mRNA組裝及染色體有絲分裂等生物過程，這與CBX1參與染色質結構和基因表達調控的功能類似，同時也與目前已經報道的組蛋白和染色體對腫瘤細胞的調控機制相吻合[13-14]。組蛋白的去乙酰化與腫瘤的發生、發展密切相關，組蛋白H3和H4的乙酰化修飾被證實參與了胃癌的發生。染色體的非整倍性是腫瘤細胞的常見特征，也是腫瘤發生的原因之一，而一些針對有絲分裂紡錘體聚合物的藥物也早已被頻繁地用來治療各類腫瘤。

本研究應用生物信息學方法，分析了正常胃組織與胃癌組織中CBX1的表達差異，發現CBX1與胃癌的分級、分期和患者遠期預后相關，并分析了CBX1在胃癌中可能參與的生物學過程，有助于進一步揭示胃癌發生、發展可能涉及的分子機制，為胃癌提供早期診斷和預后相關的標志物。但是，本研究有一定局限，缺乏有效的分子生物學實驗，對這些基因在胃癌組織中的功能進行分析驗證；同時，在進行CBX1與胃癌患者臨床病理參數相關分析時，由于此數據分期與分級所納入病例數較少，有可能對結果的準確性造成影響。盡管如此，本研究仍有利于全面深入了解胃癌的潛在分子機制，并為后續的分子生物實驗提供指導。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析，闡明了CBX1的表達與胃癌發生及胃癌患者病理參數之間的相關性，初步證實了CBX1可作為胃癌早期診斷及預后的標志物。