女性生殖道菌群改變與人乳頭瘤病毒持續感染的相關性研究

畢慶慶，朱婕，張磊，牟曉峰

根據Global Cancer Statistics 2018的統計，全世界范圍內每年約有57萬例新增宮頸癌患者，宮頸癌致死的患者約為31.1萬例［1］。在全球范圍內，宮頸癌的發病率和病死率均排在所有女性腫瘤的第四位［1］。而在宮頸癌篩查措施相對欠缺的發展中國家女性中，宮頸癌的發病率和病死率均排在第二位，僅次于乳腺癌［1］。一種或多種高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染是導致宮頸瘤變的必要和高危因素［2］。宮頸上皮內瘤變（CIN）是宮頸惡性病變的前兆，病理分級從低到高依次為CIN1級、CIN2級和CIN3級。高危型HPV感染出現在90%以上的宮頸癌和60%以上的CIN患者中［3］。

生殖道內正常的定植菌群、宿主免疫調節以及宮頸陰道解剖結構之間構成動態平衡的微生態系統，保持著生殖道的健康狀態［4］。近年來，越來越豐富的研究證據顯示，生殖道的菌群環境和菌群結構改變與HPV感染、持續感染和黏膜局部免疫以及CIN進展關系緊密［5］。本研究分析了HPV持續感染患者、HPV一過性感染患者及健康體檢者的生殖道菌群情況，發現了一些與HPV持續感染相關的菌群，這將為更早地將HPV持續感染和一過性感染患者區分提供幫助，甚至提早干預、逆轉持續感染，進而有效地降低宮頸癌發病率，具有重要的臨床意義。

本研究價值：

本研究分析了人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染者和HPV一過性感染者的生殖道菌群特征，找出了與高危型HPV持續感染密切相關的生殖道定植菌屬，為差異菌種成為潛在的宮頸惡性病變生物標志物提供了數據支持，為宮頸惡性病變的預防提供了新策略、新技術，具有理論與臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年1—6月于青島市中心醫院婦科體檢或診治的女性15例，根據HPV感染情況共分為HPV持續感染組6例、HPV一過性感染組4例、HPV陰性組5例，均為健康體檢者。根據文獻報道，將同一型別HPV感染持續12個月以上定義為HPV持續感染者，12個月內HPV感染清除定義為HPV一過性感染者［6］。

納入標準：年齡21～65歲，有性生活史，48 h內無陰道沖洗，3 d內無性生活史、陰道上藥史，1個月內未系統性使用抗生素或抗真菌藥物。排除標準：有流產史且目前妊娠，子宮全切手術史，有其他基礎性疾病。本研究經青島市中心醫院倫理委員會審查通過；研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 宮頸脫落細胞標本由婦科醫生采集：通過窺陰器暴露宮頸，拭去宮頸口及周邊分泌物，使用細胞刷刮取宮頸管上皮，在宮頸管內旋轉360°并停留5 s后取出。每例患者收集兩份宮頸標本，分別用于HPV基因分型分析和16s rRNA測序。采集宮頸標本后使用專用采集管儲存、送檢。

1.2.2 基因型分析 HPV基因分型分析采用PCR反向點雜交法。對樣本進行核酸提取后進行PCR擴增，將擴增產物加入全自動核酸雜交儀進行雜交反應。陰性結果判讀標準：僅內質控點（Internal Control）顯色；陽性結果判讀標準：內質控點顯色且相應基因型處顯色視為特定基因型陽性。

1.2.3 生殖道樣本的16s rRNA測序 16s rRNA測序流程如下：第一步：DNA提取與檢測，采用CTAB法提取樣本基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μl。第二步：PCR擴增，以稀釋后的基因組DNA為模板，采用正向引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增16s rRNA基因的V4區域。PCR反應采用Phusion?高保真PCR Master Mix （New England Biolabs）進行。反應程序：98 ℃預變性1 min；30個循環（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。第三步：PCR產物純化，將等量的1X緩沖液（含SYB green）與PCR產物混合，在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用Gene JETTM凝膠提取試劑盒（Thermo Scientific）對混合PCR產物進行純化。第四步：文庫制備及上機測序，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns（Thermo Scientific）生成測序文庫，通過Qubit@ 2.0熒光計（Thermo Scientific）進行文庫質量評估。最后在Ion S5TM XL平臺上對文庫進行測序。

1.2.4 數據分析 第一步：對原始數據進行拼接、過濾，獲得有效數據（Clean Data）。第二步：基于有效數據進行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類分析和物種分類分析。第三步：對每個OTUs的序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對OTUs進行物種豐度、Alpha多樣性分析。第四步：對OTUs進行多序列比對并構建系統發生樹，探究不同樣本或組別間微生物群結構的差異。第三、四步均基于OTUs聚類分析結果進行。第五步：采用t檢驗、Wilcox檢驗、LEfSe等統計分析方法對不同組別樣本的物種組成和菌群結構進行差異性分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組生殖道菌群特征 選取每個樣本和三組在門水平上最大豐度排名前10名的物種，以反映物種的相對豐度。HPV陰性組和HPV一過性感染組的生殖道菌群結構相對單一，厚壁菌門占據主要地位；而HPV持續感染組的生殖道菌群結構呈現復雜化趨勢，變形菌門和擬桿菌門的豐度較高（見圖1）。

2.2 樣品Alpha多樣性分析 HPV持續感染組豐度、Shannon指數高于HPV一過性感染組和HPV陰性組，差異有統計學意義（P=0.006 6、0.024 6；P=0.004 6、0.001 8）；HPV一過性感染組和HPV陰性組豐度、Shannon指數比較，差異無統計學意義（P=0.419 1、0.806 1，見圖2）。

2.3 物種顯著性差異分析 HPV持續感染組和HPV一過性感染組厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門平均物種豐度比較，差異有統計學意義（P<0.05，見表1）。對組間的物種豐度數據通過秩和檢驗分析組間的差異物種，并通過線性判別分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）進行降維分析，從而評估和計算差異顯著物種對群落的影響大小，即得到LDA score，發現LDA score>4的Biomarker共有36個（見圖3A）。根據整體上展示差異物種在不同組別間分布情況的Heatmap圖，具有顯著性差異的菌屬主要包括不動桿菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等（見圖3B）。

圖1 三組物種相對豐度分布Figure 1 Taxonomy relative abundance at phylum level

圖2 三組Alpha多樣性Figure 2 Alpha diversity

表1 HPV持續感染組和HPV一過性感染組的差異菌門（ ±s）Table 1 Bacteria phylum differences between persistent and transient HPV infection groups

表1 HPV持續感染組和HPV一過性感染組的差異菌門（ ±s）Table 1 Bacteria phylum differences between persistent and transient HPV infection groups

注：HPV=人乳頭瘤病毒

組別 例數 厚壁菌門 變形菌門 擬桿菌門HPV持續感染組 6 0.301 4±0.196 6 0.281 1±0.191 2 0.105 6±0.052 0 HPV一過性感染組 4 0.880 5±0.194 1 0.011 8±0.016 8 0.005 1±0.005 4 t值 -4.585 2.754 3.775 P值 0.002 0.025 0.013

圖3 LEfSe分析結果Figure 3 Results of LEfSe analysis

3 討論

近年來，有研究證實宮頸惡性病變的發生與高危型HPV的持續感染相關［7］，一般認為高危型HPV感染持續12個月以上未清除即為持續感染［6］。HPV持續感染導致宮頸局部微環境變化，隨之而來的是免疫抑制、細胞增殖、血管形成及組織分化等，這一系列過程中任何調控因子的改變均可能會引起宮頸細胞的癌變。因此，早期區分HPV持續感染和HPV一過性感染是宮頸癌臨床研究中亟待解決的問題之一，且該問題的解決將為宮頸癌的早期干預、持續感染的逆轉提供依據，對降低宮頸癌的發病率具有重要的臨床意義。

系統性的生殖道菌群研究在近幾年逐漸興起，2011年PNAS雜志上的一項研究首次提出將陰道菌群分為5個類群（community state types，CST），其中CSTⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型分別代表了以卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、惰性乳桿菌和詹氏乳桿菌為優勢的類型，CSTⅣ型以厭氧菌為優勢菌群、乳桿菌明顯減少［8］。CSTⅠ、Ⅱ、Ⅴ型的陰道菌群一般代表正常的陰道菌群類型，而CSTⅣ型代表的是菌群多樣性顯著增加的異常陰道菌群類型。值得注意的是，以惰性乳桿菌為代表的CSTⅢ型代表了陰道菌群的亞健康狀態，該類菌群最容易向CSTⅣ型轉化并誘發疾?。?］。另外，上述研究大多基于北美白種女性，也提及女性生殖道菌群特征在不同人種中具有顯著差異［8］。在健康女性中，有80%的亞洲女性和60%的西班牙裔女性生殖道菌群以乳桿菌占優勢，在黑人女性中這一數值則低至37%～40%［10］。因此，了解特定人群健康與疾病生殖道菌群特征對進一步理解其與宿主免疫系統的相互作用、引發疾病的機制具有重要意義。

本研究結果顯示，本地區HPV陰性的健康女性的宮頸菌群結構相對單一，以乳桿菌為主；而在高危型HPV持續感染者中，宮頸菌群多樣性明顯增加，且菌群組成中厭氧菌的比例顯著上升，這和中國西北地區和南方地區的高危型HPV感染與微生物組成相關性分析結果一致［11-12］。此外，在HPV持續感染的患者中，包含乳桿菌屬的厚壁菌門的豐度顯著降低，而變形菌門和擬桿菌門的豐度則顯著增高，這或與HPV持續感染相關，是HPV持續感染的高危因素。

目前國內的類似研究多將研究對象確定為宮頸癌患者、HPV陽性患者或陰性就診者，較少關注持續感染這一更常見的臨床表現，本研究以HPV持續感染者和HPV一過性感染者為研究對象，進行16s rDNA測序，進一步利用統計分析方法尋找到36個在組間有顯著差異的物種，其中具有顯著性差異的代表性菌屬包括不動桿菌屬、普雷沃菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等，這為區分HPV持續感染和HPV一過性感染患者提供了有效的方式，有著更直接的臨床意義。之前的一項研究表明，對于普雷沃菌屬和假單胞菌屬豐度較高的女性，HPV清除更為困難，且更容易發展為持續感染［13］。另外，本研究還發現鞘氨醇單胞菌屬與HPV持續感染相關，但在已發表文獻中尚未報道，而差異菌屬與HPV和宿主免疫之間的相互作用需要進一步研究?？傊?，上述結果將為區分HPV持續感染和HPV一過性感染提供一種有效的方法，具有一定的臨床意義。

雖然本研究結果提示生殖道菌群改變與HPV持續感染相關，但是以目前的研究結果無法判斷是菌群結構的改變導致了HPV持續感染，還是HPV持續感染引起了菌群結構的改變。進一步的研究應當關注整個生殖道微環境，研究生殖道菌群、HPV感染和宿主免疫系統的相互作用在宮頸癌前病變發生發展中的作用。此外，本研究樣本量偏少，應進一步擴大樣本檢測量，找到HPV持續感染相關的特定菌屬，還可使用單分子測序技術（single molecule real time，SMRT）檢測樣本，而將差異菌注釋到種水平則有更顯著的臨床意義。

作者貢獻：畢慶慶、張磊、牟曉峰進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋，文章的撰寫及審校；畢慶慶、朱婕、張磊進行研究的可行性分析與具體實施，包括數據采集、整理、分析；畢慶慶、張磊進行統計學處理；牟曉峰進行論文的修訂，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。