復方板藍根制劑中靛玉紅提取工藝的研究

張前珍 李懂琴 陳國良

板藍根和大青葉是中藥復方板藍根制劑主要成分，是我國傳統的中藥。板藍根為十字花科植物菘藍的干燥根，其主要化學成分為靛玉紅和靛藍等，有清熱解毒、涼血利咽功能，用于瘟毒發斑、療腮、喉痹、爛喉丹府、大頭瘟疫、丹毒、癰腫等癥，板藍根的主要化學成分為靛玉紅和靛藍等，臨床上常用于病毒性及細菌性感染疾病[1]。大青葉為十字花科菘藍的葉，其主要化學成分為有機酸、靛藍、靛玉紅、菘藍苷、色胺酮等化合物[2]。現代藥理研究表明具有抗菌、抗癌、抗病毒、增強免疫調節作用[3]。目前，復方板藍根制劑有顆粒劑、沖劑、糖漿劑、片劑、口服液等，對板藍根和大青葉中有效成分靛玉紅的提取，傳統的提取方法是水煎煮醇沉，其有效成分損失過大，為了最大限度提取有效成分，本實驗分別采用水和乙醇為溶媒，用正交試驗設計法，以確定合理的提取工藝路線和最佳提取條件，靛玉紅為指標進行比對，為復方板藍根制劑的生產提供科學依據。

1 儀器和材料

1.1 試藥 中藥板藍根：批號：170101；大青葉：批號：170301（產地：甘肅）。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：U3000（Thermo Fisher美國）；電子天平：SARTORIUS CPA2250（德國，dz0.01 mg）；電熱恒溫水浴鍋HWS-2b（上海）；KQ5200E超聲清洗器（昆山）。

1.3 試劑 甲醇，色譜純；超聲重蒸餾水（自制）；乙醇，分析純。

1.4 對照品 靛玉紅（批號：110717-200204）。

2 方法和結果

2.1 靛玉紅含量測定 ①條件：色譜柱：AgilentC18,ZORBAX 58- Aq（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（58:42）；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 mm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；時間：40 min。②對照品溶液制備：精密稱取靛玉紅對照品9.52 mg置50 mL量瓶中，加甲醇稀至釋度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋度，搖勻，制成每1 mL約含2 μg的靛玉紅對照品溶液。③供試品溶液的制備：精密稱取以水為溶媒和以乙醇為溶媒L9（34）正交試驗的清膏各1 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，精密稱重，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。④測定靛玉紅含量：精密吸取對照品溶液20 μL，再按試驗號分別吸取L9（34）正交試驗供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀中測定含量。

2.2 試驗方法 按照復方板藍根制劑中板藍根和大青葉的比例，分別以水和乙醇為溶劑進行水煎煮提取和回流提取，以靛玉紅作為檢測指標，進行L9（34）正交試驗，根據正交試驗結果，進行比較、分析、驗證試驗和重復試驗，最后得出結論。

2.2.1 水煎煮提取的正交試驗 平行稱取板藍根30 g、大青葉45 g各9 份，按照L9（34）正交試驗設計的因素水平表進行水煎煮提取，合并濾液，濃縮，醇沉，過濾，濾液濃縮（回收乙醇）成清膏，備用。按照2.1.4 項測定靛玉紅的含量。見表1、表2。

2.2.2 乙醇回流提取的正交試驗 平行稱取板藍根30 g、大青葉45 g各9 份，按照L9（34）正交試驗設計的因素水平表進行回流提取，合并濾液，濃縮（回收乙醇），再醇沉，過濾，濾液濃縮（回收乙醇）成清膏，備用。按照2.1 中的第4 項測定靛玉紅的含量。見表3、表4。

表1 水煎煮提取工藝正交試驗因素水平表

表2 水煎煮提取工藝L9（34）正交試驗結果

表3 乙醇回流提取工藝正交試驗因素水平表

表4 乙醇回流提取工藝L9（34）正交試驗結果

3 結 果

根據實驗數據算出極差值R的大小，反映各因素對指標性成分靛玉紅的影響程度。

3.1 水煎煮提取的最佳工藝 根據正交試驗設計水煎煮提取板藍根和大青葉中靛玉紅，從表2中看出，因素D（溫度）對提取靛玉紅總量有顯著性影響，因素B（次數）和因素A（時間）對提取靛玉紅總量影響非常顯著，因素C（水量）無顯著性影響，實驗結果表明水煎煮提取板藍根和大青葉中靛玉紅的最佳提取條件：D3 B2 A3 C1 即溫度100 ℃、次數2 次、時間2 h、水量8 倍。對上述結果我們進行驗證和重復實驗，結果見表5。

表5 水煎煮提取板藍根和大青葉中靛玉紅驗證試驗和重復試驗

3.2 乙醇回流提取的最佳工藝 根據正交試驗設計乙醇回流提取板藍根和大青葉中靛玉紅，從表4 中看出，因素A（乙醇濃度）對提取靛玉紅總量有顯著性影響，因素B（回流時間）和因素D（乙醇用量）對提取靛玉紅總量影響非常顯著，因素C（回流次數）影響較小，實驗結果表明乙醇回流提取板藍根和大青葉中靛玉紅的最佳提取條件：A3B2D2C2，即乙醇濃度80%、回流時間80 min、乙醇用量7 倍、回流次數2 次。對上述結果我們進行驗證和重復實驗，結果見表6。兩種不同溶劑和提取工藝通過正交設計并進行L9（34）正交試驗進行優化，對優化后的提取工藝條件進行驗證和重復試驗，其結果基本一致。

表6 乙醇回流提取板藍根和大青葉中靛玉紅驗證試驗和重復試驗

3.3 兩種不同溶劑和提取工藝的比對 采取兩種不同溶劑和不同提取工藝，用優化的最佳工藝條件提取靛玉紅，結果顯示：乙醇回流法提取板藍根和大青葉中有效成分靛玉紅是水煎煮法提取靛玉紅的97 倍。見表7。

表7 兩種不同溶劑和提取工藝提取靛玉紅總量的比對

4 討 論

本文選擇的溶劑和提取工藝理論依據，根據靛玉紅的溶解性來確定。靛玉紅溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇，根據人用藥品注冊技術要求國際協調大會（ICH）制定的指導原則[4]要求，氯仿屬于第二類溶劑，乙酸乙酯、丙酮、乙醚屬于第三類溶劑，不能使用，所以本實驗選擇乙醇和水為溶劑。

目前，復方板藍根制劑（包括片劑、顆粒劑、沖劑、糖漿劑、口服液等）大部分都是采取水煎煮醇沉提取，復方板藍根制劑的有效成分靛玉紅不溶解水，即使在煮沸時溶解很少。本實驗證明，即使用正交試驗優化工藝后提取的靛玉紅也是很少，制劑產品質量很難控制。曾經有報道[5]用65%乙醇進行回流或滲漉提取來提高制劑產品質量。我國中醫用清熱解毒法在治療溫熱病中地位很重要，與現代醫學治療感染性疾病應用抗菌藥物為基本手段相一致，板藍根是清熱解毒中藥的典型藥物[6]，在抗擊SARS過程中，以中國中醫藥研究院專家牽頭的治療小組從1000 多個中成藥方中篩選出8 個有效的藥物，其中有板藍根顆粒劑。所以，研究復方板藍根制劑有效成分提取工藝，對板藍根的開發利用有著重要意義。