循環長鏈非編碼RNA 作為生物標記物用于結直腸癌診斷的meta 分析

江梅，萬臘根，萬勁華，聶益軍，劉淑媛，呂小林，張長林

（南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南 昌 3 30006）

結直腸癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，每年有超過60 萬人因結直腸癌死亡[1]。若結直腸癌能夠早期發現和診斷,結直腸癌相關的死亡可明顯降低。結直腸癌I 期患者5 年生存率可達93%,II 期患者也超過80%, 而晚期患者少于10%[2,3]。由于早期結直腸癌患者沒有明顯的臨床癥狀，所以多數患者在確診時已經是晚期。目前常用的早期診斷技術有結腸鏡、大便隱血試驗、大便DNA檢測以及腫瘤標志物檢測。結腸鏡檢查被認為是目前結直腸癌診斷的 “金標準”,但其有創、花費高、有醫療風險等特點限制其在結直腸癌篩查中應用。大便隱血試驗由于無創、花費少、取材方便的特點被廣泛地運用到結直腸癌的篩查中,但其靈敏度低,且取材前需要苛刻的飲食控制。大便DNA 檢測由于樣本處理過程繁瑣以及花費高等特點限制其在結直腸癌中的廣泛運用[4]。腫瘤標志物CEA 以及CA199 診斷結直腸癌的靈敏度和特異度也不理想[5]。因此，仍迫切需要尋找可用于結直腸癌早期診斷的新方法。

長鏈非編碼RNA (long non-protein coding RNA，lncRNA)是在真核生物中新發現的一類長度大于200 個核苷酸,不具備蛋白編碼能力的非編碼RNA。越來越多的證據表明lncRNA 在腫瘤細胞增殖，凋亡，浸潤以及轉移起重要作用[6-8]。近年來，許多研究證實lncRNA 可作為生物標記物用于結直腸癌的診斷[9-17]。但這些研究結果中lncRNA 的診斷效能并不完全一致，因此本研究利用 Meta 分析的方法，對lncRNA 在結直腸癌中的診斷價值進行系統性評價。

1 材料與方法

1.1 檢索策略 兩名研究人員獨立檢索英文數據庫PubMed, Embase 以及OVIDSP, 檢索截止日期2018 年 10 月 1 日。英文數據庫主要檢索詞為(‘Lo ng Noncoding RNA’ OR ‘LncRNA’ OR ‘Long ncRNA’ OR ‘Long Non-Translated RNA’ OR ‘Lo ng Nontranslated RNA’ OR ‘Long Non-Coding RN A’ OR ‘Long Non-Protein-Coding RNA’ OR ‘Lo ng Untranslated RNA’ OR ‘Long ncRNAs’ OR ‘Lo ng Intergenic Non-Protein Coding RNA’ OR ‘LincRNAs’ OR ‘LINC RNA’ OR ‘Long Non Protein Coding RNA’) AND (‘circulating’ OR ‘serum’ OR‘sera’ OR ‘blood’ OR ‘plasma’)AND (‘colorectal’OR ‘colon’ OR ‘colonic’ OR ‘rectal’ OR ‘rectum’) AND (‘cancer’ OR ‘carcinoma’ OR ‘tumor’OR ‘neoplasm’)。此外，對原文及綜述所列出的參考文獻進行手工檢索。

1.2 文獻納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴結直腸癌患者均經結腸鏡或病理組織學確診；⑵明確給出IncRNA 診斷的靈敏度和特異度,或通過間接計算能夠得到診斷試驗四格表數據；⑶研究的樣本類型為血漿或血清；⑷國籍和種族不限，發表語種為英文。

1.2.2 排除標準 ⑴文獻重復；⑵書信、會議報告、綜述、評論和未經校對的論文；⑶無法計算出四格表數據或數據不全。

1.3 數據提取 文獻提取信息包括第一作者姓名、發表時間、國家、病例組人數、對照組人數、樣本類型、lncRNA 的檢測方法、lncRNA 的名稱，診斷性能指標主要包括曲線下面積 （Area under the curve，AUC）、靈敏度（Sensitivity，SEN）、特異度（Specificity，SPE）、真陽性（True positive，TP）、假陽性（False positive，FP）、假陰性（False negative，FN）以及真陰性（True negative，TN）。數據提取由兩名研究人員分別獨立完成，若兩人提取結果不一致，則需共同研究后達成一致。

1.4 文獻質量評價 納入文獻的質量評價參照Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies 2(QUADAS-2)[18]。QUADAS-2 是在 QUADAS 的基礎上改進后用于診斷性試驗的質量評價工具,由四個域組成（patient selection，index test，reference standard 以及 flow and timing）。前三個域的標志性問題按“high”、“unclear”、“low”評分以判斷偏倚風險及適用性。

1.5 統計學分析 使用雙變量隨機效應模型合并靈敏度（SEN）、特異度（SPE）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）、診斷比值比（DOR）[19]，同時合并總的受試者工作特征曲線 （SROC） 并計算出曲線下面積（AUC）。異質性檢驗包括閾值效應檢驗和非閾值效應檢驗。閾值效應通過Spearman 相關系數和 SROC 曲線形態評價。若 SROC 曲線呈現“肩臂狀”分布，則存在閾值效應；若 SROC 曲線不呈“肩臂狀”分布且 Spearman 相關系數 P＞0.05，則不存在閾值效應。非閾值效應由 Cochran’s Q 檢驗和I2（inconsistency index ）檢測,若 P＜0.05 或 I2＞50%提示存在非閾值效應。亞組分析和Meta 回歸用于分析異質性原因。Deek’s 檢驗用于發表偏倚判斷和評估[20]。所有數據采用Meta-Disc 和STATA 12.0軟件進行統計分析[21]。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 文獻檢索結果以及納入研究的基本特征 按標準篩選文獻流程，最終納入9 篇文獻，其中包括17 項研究。文獻的篩選流程見圖1,納入研究的基本特征見表1。文獻共包括 833 例結直腸癌患者和688 例對照。8 篇文獻的結直腸癌患者均經結腸鏡或病理組織學確診，1 篇文獻未說明[14]，我們與作者聯系后確認了該研究中的所有結直腸癌患者均經病理組織學確診。因此，833 例結直腸癌患者均通過“金標準”確診。文獻的發表年限為2011 年至2017 年。其中以中國人為研究對象的文獻有8 篇，以澳大利亞白人為研究對象的1 篇。5 篇文獻的樣本類型為血漿，其余4 篇文獻的樣本類型為血清。17 項研究中15 項是評價單一IncRNA 的診斷價值，1 項是評價聯合三種IncRNAs 的診斷價值，1項是評價聯合四種IncRNAs 的診斷價值。所有的研究都是采用定量PCR (quantitative PCR ,qPCR)方法檢測。

圖1 文獻篩選流程

2.2 質量評價 納入研究均采用QUADAS-2 進行質量評價。如圖2A 以及2B 所示，主要的偏倚發生在“patient selection”，所有納入文獻的質量達到相對較高的水平。

2.3 循環lncRNAs 在結直腸癌中的診斷價值 圖3A 以及3B 分別為lncRNA 診斷結直腸癌的合并SEN，合并SPE 的森林圖。結果顯示IncRNA 診斷結直腸癌的合并SEN、合并SPE、合并 PLR、合并NLR 以及合并 DOR 分別為 0.77 (95%CI：0.72～0.8 1)，0.83(95%CI：0.76～0.88)，4.5 (95%CI：3.2～6.4)，0.28 (95%CI：0.22～0.35)以及 16 (95%CI：9～27)。圖4 為 SROC 曲線圖，結果顯示 AUC 為 0.86(95%CI：0.83～0.89)， 結果提示循環 lncRNA 在結直腸癌中的診斷價值較高。

表1 納入研究的基本特征

圖2 偏倚風險和適用性問題圖(A)以及偏倚風險和適用性問題總結圖(B)

2.4 異質性檢驗，Meta-回歸以及亞組分析 閾值效應是導致異質性的重要原因之一,它是指診斷試驗各研究間陽性結果和陰性結果判斷標準存在差異所引起的異質性。Spearman 相關系數是分析閾值效應的一種有效方法[22,23]。在本研究中,Spearman相關系數為-0.287，P= 0.264 (P＞0.05)，提示不存在閾值效應。SROC 曲線未呈現肩臂狀效應，進一步說明納入研究不存在閾值效應。采用Cochran’s Q檢驗和I2 檢驗分析有無非閾值效應，結果顯示，靈敏度I2、特異度I2、陽性似然比I2、陰性似然比I2、診斷比值比I2 分別為80.61%(P=0.00),85.22%(P=0.00),81.25%(P=0.00),86.00%(P=0.00) 以及100%(P=0.00)，提示存在顯著非閾值效應。為進一步尋找引起異質性的原因，根據樣本量(＞60 vs≤60)、種族(亞洲人 vs 白人)、IncRNA 研究模式(聯合 vs 單一)、樣本類型(血漿vs 血清)做亞組分析，結果顯示異質性主要來源于樣本量以及樣本類型， 樣本量≤60組的特異度優于樣本量＞60 組(0.87vs0.81)，樣本類型為血漿組的靈敏度優于血清組（0.79vs0.74）。見圖 5、表 2。

圖3 循環lncRNAs 診斷結直腸癌的合并靈敏度(A)，合并特異度(B)的森林圖

圖4 循環lncRNAs 診斷結直腸癌的SROC 曲線

2.5 發表偏倚 Deek’s 檢驗用于發表偏倚判斷和評估。P 值為0.80，提示各研究間不存在發表偏倚,見圖6。

3 討論

表2 循環lncRNAs 診斷結直腸癌亞組分析的靈敏度和特異度

圖5 循環lncRNAs 診斷結直腸癌亞組分析的靈敏度和特異度

近年來，有不少研究報道lncRNA 在腫瘤細胞增殖，凋亡，浸潤以及轉移發揮重要作用[6-8]。并且，lncRNAs 不僅在腫瘤組織扮演重要角色，而且可作為循環標記物用于腫瘤診斷，如結直腸癌的診斷[9-17]。然而，它們的診斷效能仍不明確。目前國內外未見關于循環IncRNA 在結直腸癌中診斷價值的系統性評價。本研究利用 Meta 分析的方法，對循環lncRNA 在結直腸癌中的診斷效能進行綜合評價。

圖6 Deek’s 檢驗用于發表偏倚判斷和評估

在本研究中,納入的9 篇文獻共包括 833 例結直腸癌患者和688 例對照。使用雙變量隨機效應模型合并 SEN、SPE、PLR、NLR、DOR 分別為 0.77(95%CI：0.72 ～0.81)，0.83 (95%CI：0.76 ～0.88)，4.5(95%CI：3.2～6.4)，0.28 (95%CI：0.22～0.35)以及 16(95%CI：9～27)。SROC 曲線 圖顯 示 AUC 為 0.86(95%CI：0.83～0.89)。有文獻報道[24],CEA 以及 CA1 99 診斷結直腸癌的靈敏度僅僅為11.1%和7.7%，Wang J 等研究結果顯示CEA 以及CA199 診斷結直腸癌的 AUC 值也僅為 0.649 以及 0.598[25]。循環miRNAs 作為一種新的血液標記物，在結直腸癌診斷中也有相對較高的診斷價值，靈敏度，特異度以及 AUC 值分別為 78% 、79%、 0.87[26]。我們研究發現lncRNAs 的診斷效能與miRNAs 相似, 但是與lncRNAs 相比，miRNAs 的逆轉錄過程更為繁瑣耗時。因此，我們得出結論與其它無創性血液標記物相比,有著高靈敏度以及特異度的循環lncRNAs 在診斷結直腸癌中更為優越。診斷結直腸癌的陽性似然比PLR 以及陰性似然比NLR 為4.5 (95%CI：3.2～6.4),0.28(95%CI：0.22～0.35),結果提示循壞 lnc RNAs 確診或排除結直腸癌的能力相對較弱。DOR作為一個綜合診斷指標, 其值在0 至無限大之間[27]，DOR=1 提示該檢測不能很好地將結直腸癌患者組和對照組區別開。DOR 值越高，檢測的診斷效能越好。在本研究中,DOR 為16,結果提示循環lnc RNAs 作為潛在的生物學標記物在結直腸癌中的診斷價值較高。

總的來說,異質性主要來源于閾值效應以及非閾值效應。幸運的是，本研究中的異質性并非來自閾值效應，而是來源于非閾值效應。為進一步尋找引起異質性的原因，根據樣本量(＞60 vs≤60)、種族(亞洲人 vs 白人)、IncRNA 研究模式(聯合 vs 單一)、樣本類型(血漿vs 血清)做亞組分析，結果顯示異質性主要來源于樣本量以及樣本類型, 樣本量≤60組的特異度優于樣本量＞60 組(0.87vs0.81)。納入研究的結直腸癌患者數量是在15 至220 之間，樣本量的差異可能導致異質性。為了增加研究數量，我們對樣本量沒有嚴格的標準。另外，樣本類型為血漿組的靈敏度優于血清組（0.79vs0.74）。血漿除含有凝血因子以外，其它成分基本與血清相同。在診斷性試驗中，血漿和血清都是常見的樣本類型，血漿或血清在循環lncRNAs 的檢測中哪一個更優越尚不明確。因此，仍然需要進一步的研究證實循環lncRNAs 的檢測與樣本類型相關。本研究結果顯示種族或IncRNA 研究模式的差異并不會導致異質性，這與以往的研究發現IncRNA 的聯合檢測診斷價值更高的結論不一致[16]。而在本次系統性評價中,只有兩篇文獻是IncRNA 的聯合檢測，納入的研究數量較少。因此，仍然需要進一步的研究證實IncRNA 聯合檢測的診斷價值。

盡管本研究結果顯示循環lncRNAs 可作為潛在的生物標記物用于結直腸癌的診斷,但仍存在一些局限性。第一，納入的研究數量相對較少，仍需更多的研究才能給出肯定性的結論。第二,本研究存在一些偏倚, 所有納入的研究都為病例對照研究,另外,大多數納入的研究對于是否是連續性樣本還是隨機樣本以及研究是否避免了不恰當的排除沒有明確說明，這些都導致了文獻質量評價‘patient selection’域偏倚為高風險，進一步的研究需要避免這些偏倚。第三，納入的研究中除了一項研究來自澳大利亞其余都來自中國，因此，納入研究的患者大多數都是亞洲人。白種人以及非洲人的研究也是必不可少的。

綜上所述， 循環IncRNAs 對結直腸癌具有較高的診斷價值， 可作為結直腸癌診斷的潛在生物標記物。但仍需要進一步大樣本的研究來證實我們的結論。