miR-542-3P 對肝細胞癌診斷和預后判斷的臨床價值研究

馮建超 ，周進學 ，靳根峰 ，劉勇

（1.河南省新鄭市人民醫院普外科，河南 新鄭 451150；2.河南省腫瘤醫院肝膽胰外科，河南 鄭州 450008）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,病死率位居所有腫瘤性疾病的第三位。我國是肝癌高發國家,發病率、死亡率一直處于較高水平[1,2]。近年來,隨著生活結構的改變及飲食結構的調整,肝癌的發病率呈不斷遞增趨勢,嚴重威脅我國居民的生命健康[3]。肝癌病情初期較為隱匿,臨床癥狀不明顯,且由于肝臟結構的特點,很難區分肝臟惡性腫瘤及肝臟局灶性良性病變,誤診率較高,只有少數患者能夠在病情早期得到確診及治療, 多數患者出現臨床癥狀時,已處于病情的中晚期,失去了最佳的手術時機,患者預后往往較差,復發率較高[4]。對肝癌進行早診斷、早治療是降低死亡率、提高治療效果的關鍵。尋找敏感度高、 特異度好的肝癌標志物對肝癌的治療具有重要的意義。

微小 RNA （micro RNA,miRNA） 為一類長度19-24 個核苷酸的非編碼RNA[5],與細胞的分裂、增殖、分化、凋亡、突變等多種生命活動密切相關[6],其中 miR-542-3p 位于 X 染色體的 q26.3 區域。近年來研究提示miR-542-3p 可通過抑制蛋白激酶抑制抑制腫瘤內皮細胞的增殖及分化,在多種腫瘤細胞中異常表達[7]。miR-542-3p 在肝癌組織細胞中的含量下調,且影響肝癌細胞的增殖、轉移及侵襲[8],對于血清中miR-542-3p 的報道較少,在本次研究中以在該院接受治療的60 例患者為研究對象,對患者血清中 miR-542-3P 的水平進行分析,進而為肝癌的診斷、治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取 2019 年 1 月至 2019 年 7 月在該院接受治療的60 例肝癌患者為觀察組, 其中男性患者為32 例,女性患者為28 例,年齡分布為39～72 歲,平均年齡為 49.28±9.68 歲。選取同時期的健康體檢者60 例,其中男性患者33 例,女性患者 27 例,年齡分布為 41～75 歲,平均年齡為 50.36±8.58 歲,兩組患者在年齡、性別方面無明顯差異（P＞0.05）,具有可比性。所有患者均同意參與本次研究并簽訂相關文件,該研究經醫院倫理學會批準。

納入標準 年齡≥18 周歲,性別不限；已經病理學檢查確診為肝癌；依從性好,能夠配合完成各項檢查及治療；精神正常,可進行正常溝通交流；自愿參加本次研究；臨床資料完整。

排除標準 未被確診的患者；合并心、肝、腎等重要臟器等重大疾病患者；合并其他惡性腫瘤的患者；存在精神障礙的患者；脫落標準 符合納入標準,在研究過程中患者出現嚴重并發癥或病情不穩定,急劇加重的患者；由于各種原因,患者主動退出者或失訪患者；研究期間死亡的患者。

1.2 主要試劑及儀器 主要儀器：實時熒光定量PCR 分析儀（TL988-2；濟南卓隆生物科技有限公司）；高速離心機（Optima XPN；貝克曼）；miRNA 逆轉錄試劑盒(德國 QIAGEN 公司)；RNA 提取試劑盒(上海華藍化學科技有限公司)；反轉錄儀（StarScript；北京康潤誠業生物科技有限公司）；高速勻漿機（FLUKFA25；德國弗魯克）、超凈工作臺（SW-CJ-1D；蘇州凈化)； miR-106b 上游引物 5’-TAAAGTGCTG -ACAGTGCAGAT-3’（Invitrogen 公司）。

1.3 方法 ⑴血清中總RNA 的提取：清晨取靜脈血10ml 置采血管中,靜置10min 后5000r/min 離心10min,棄去沉淀,取 200μl 按照血清 RNA 提取試劑盒說明書提取總血清中RNA, 其余血清放-80℃冰箱保存備用。⑵合成cDNA 第一鏈 采用加尾法進行合成, 在 16℃ 30 min,42℃ 30 min,85℃ 5 min,進行反轉錄,生成cDNA),結束后將cDNA 分裝于EP管中,保存于-80℃冰箱保存備用。⑶實時熒光定量分析：加入底物、 試劑共計 20μl, 條件為：95℃15min,92℃ 15s,60℃ 30s,70℃ 35s,共計 40 個循環。對相應信號進行采集,每個點的信號取3 次,取平均值,采用Cei-miR-39 作為參照測定miRNA 的相對表達含量。

1.4 統計學方法 本次研究采用SPSS 20.0 統計學軟件處理實驗數據,計量資料采用進行表示,組間采用獨立樣本t 檢驗,計數資料用%表示,用卡方檢驗,P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-542-3p 的表達水平 對兩組血清中的miR-542-3p 水平進行分析, 觀察組治療前血清中miR-542 -3p 為 1.76±0.65, 治療后血清中 miR-542-3p 為2.26±0.71, 對照組血清中miR -542-3p水平為3.45±0.96,與對照組相比,觀察組中血清中miR-542-3p 水平明顯偏低, 且差異具有統計學意義（P＜0.05）。與治療前相比,觀察組血清中 miR-542-3p 水平明顯升高,且差異具有統計學意義（P＜0.05）,見表 1。

表1 觀察組及對照組血清中miR-542-3p 水平

2.2 臨床參數與miR-542-3p 水平 對臨床特征與miR-542-3p 之間的聯系進行分析比較,不同年齡、腫瘤大小組血清組中miR-542-3p 水平無明顯差異（P＞0.05）,不同分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移組血清中miR-542-3p 存在顯著差異,分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴結轉移血清中的miR-542-3p 的水平越低, 且差異存在統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

2.3 ROC 曲線 ROC 曲線分析顯示miR-542-3p區分肝癌患者與正常人曲線下面積為0.8245（95% CI：0.7483～0.9008）,差異有統計學意義（P 值為 0.0283）。當截斷值取 3.026 × 10-3時 ,敏感度與特異度分別為79. 2% 與75. 6%, 對肝癌的診斷具有一定價值。

表2 不同病理特征與miR-542-3p 水平

3 討論

圖 1 miR-542-3p 的 ROC 曲線

肝癌具有較高的發病率及致死率,嚴重威脅人類的生命安全,肝癌的病情進展較為隱匿,多數患者診斷時已處于晚期,失去了治療機會,明確癌的影響因素對疾病的防治具有重要意義。但目前的發病機制尚不明確,但主要認為與年齡、飲食習慣及環境等有關,快速、準確的診斷方法對胃癌的治療具有積極的促進作用,早診斷、早治療是治療胃癌的關鍵[9,10]。相關研究提示miRNA 在肝癌的發生及發展中起著重要作用,可對基因表達轉錄后進行調控, 在細胞的生命活動及癌變中起著重要的作用,miRNA 不僅存在于組織中, 同時也存在于外周血及其他體液中[11,12]。由于miRNA 與腫瘤細胞的增殖、分化關系密切,可作為血清標志物,在腫瘤疾病的診斷及治理中起著重要的作用。對于肝癌的診斷主要依據影像學資料及病理檢查, 仍確實少快速、方便、準確的檢查方式,miRNA 在肝癌中的診斷及預后價值成為研究的重點方向。

miR-542-3p 與多種腫瘤的發生、發展密切相關,在諸多腫瘤細胞中均表達異常。楊彬、于晶等[13]對微小miR-542-3p 在人腦膠質瘤中的表達及其對細胞增殖遷移能力進行了研究分析, 采用FQPCR 對腦膠質瘤患者腫瘤組織及顱腦外傷患者正常腦組織中miR-542-3p 的表達水平, 結果表明miR-542-3p 在腦腫瘤組織中表達水平明顯降低,且具有抑制腫瘤細胞遷移及侵襲的作用。吳寧、陸瑛等[14]對miR-542-3p 在口腔鱗狀細胞癌中的表達情況進行了研究分析,對患者癌組織及癌旁組織中miR-542-3p 的表達水平進行了測定,結果表明癌組織中的miR-542 -3p 水平明顯低于癌旁組織,且差異具有統計學意義。miR-542-3p 水平與口腔鱗狀細胞癌的發生發展關系密切,可作為疾病診斷的潛在標志物。在本次研究中肝癌患者血清中的miR-542-3p 水平明顯低于正常人血清中miR-542-3p 的含量,且差異具有統計學意義,這與之前研究具有一致性,miR-542-3p 可降低腫瘤細胞對血管內皮的粘附力,抑制腫瘤細胞的轉移,對腫瘤細胞的增殖、分化具有一定的抑制作用,同時有助于細胞的凋亡[15]。在本次研究中腫瘤分化程度越高、TNM 分期越高、 存在淋巴結轉移血清中的miR-542-3p 的水平越低,且差異存在統計學意義。miR-542-3p 在腫瘤的診斷中敏感度高、 特異性好。岑小寧、黃許森等[16]對結直腸癌患者血清miR-542-3 p 水平進行了測定, 結果表明miR-542-3 p在直腸癌的診斷中,具有較高的靈敏度,特異度,可作為診斷結直腸癌的生物學標志物. 在本次研究中,ROC 曲線分析顯示miR-542-3p 區分肝癌患者與正常人曲線下面積為 0.8245 （95% CI：0.7483～0.9008）, 敏感度與特異度分別為79.2% 與75.6%,在肝癌的診治方面具有重要意義。

綜上所述,miR-542- 3P 對肝癌的發生及發展具有一定的抑制作用, 在患者血清中表達水平較低,具有一定的靈敏度、特異度、對肝癌的診斷及預后具有一定價值。