CMIA 對HBsAg 弱反應性血清標本的檢測性能研究

黃韜 ，羅清 ，徐榮 ，曾文興 ，李俊明

（1.宜春市人民醫院檢驗科，江西 宜春 336000；2.南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330000）

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）是臨床上應用最為廣泛的判斷HBV 感染血清學標志物之一,也是WHO 推薦的診斷HBV 感染的核心指標。目前較為主流的HBsAg 檢測方法為化學發光免疫分析法（CLIA）和酶聯免疫吸附測定法（ELISA）。化學發光微粒子免疫分析法（CMIA）是化學發光法的一種,由于具有檢測靈活、自動化程度高和更易實現檢驗過程的標準化等優勢,CLIA 在臨床上的普及率越來越高。近年來, 已有一些研究對CLIA 和ELISA 技術在檢測HBV 血清學標志物方面的性能進行了比較, 研究結果均提示與ELISA 技術相比,CLIA 具有更高的檢測靈敏度和更好的精密度[1-3]。然而,HBsAg 檢測靈敏度的提高不可避免的會帶來一些新的困擾,如少見模式結果增多、弱反應性結果、甚至部分假陽性結果的增多等,目前很少有研究探討CLIA 和ELISA 技術檢測出的弱反應性結果的可靠性。

本研究旨在評價化學發光微粒子免疫分析法（CMIA）對乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）弱反應性血清標本的檢測性能,以期對臨床檢驗工作提供一定的指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有標本選自 2016 年 10 月至2018 年12 月期間在南昌大學第一附屬醫院就診的患者,其中CMIA 檢測HBsAg 弱反應性標本的納入標準為：CMIA 檢測濃度為 0.05～0.50IU/mL；ELI SA 檢測HBsAg 弱反應性標本的納入標準為：ELISA 檢測 S/CO 為 1～4,血清標本分析前、分析中處理嚴格按照標準操作規程,收集到的血清標本置于-20℃保存。

1.2 儀器與試劑 CMIA 分析系統：Architect i2000微粒子化學發光免疫分析儀, 配套HBsAg 定量檢測試劑盒、校準品均由雅培公司生產。ELISA 分析系統：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（ELISA)由廈門英科新創科技有限公司生產, 鄭州安圖DH OMO 酶標儀,DEM-3 型自動洗板機。中和確認試驗檢測系統：Architect i2000 微粒子化學發光免疫分析儀,配套HBsAg 定量檢測試劑盒、校準品、HB-sAg 確認試劑盒均由雅培公司生產。研究過程中每批次檢測均采用鄭州標源生物工程股份有限公司生產的HBsAg 血清標準物質進行質量控制。

1.3 方法

1.3.1 通過檢索檢驗信息系統中的數據 統計分析2018 年7 月至2018 年10 月在南昌大學第一附屬醫院門診就診患者 （排除感染科門診就診患者）CMIA 和ELISA 檢測血清HBsAg 的陽性率,初步了解兩種方法檢測HBsAg 敏感性差異。

1.3.2 HBsAg 弱反應性血清標本的平行檢測及結果確認 將篩選出的183 例CMIA 檢測弱反應性標本,嚴格按照乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（ELISA)試劑說明書進行HBsAg 的檢測。按照中和確認試驗試劑使用說明書,對183 例弱反應性標本在Architect i2000 微粒子化學發光免疫分析儀上進行結果確認。

將篩選出的50 例ELISA 檢測弱反應性標本,嚴格按照Architect i2000 微粒子化學發光免疫分析儀及其配套試劑的標準操作規程進行HBsAg 的檢測。按照中和確認試驗試劑使用說明書,對標本在Architect i2000 微粒子化學發光免疫分析儀上進行結果確認。

1.3.3 根據EP-15A2 文件[4],選擇一份 HBsAg 弱反應性的臨床血清標本,對該標本用CMIA 法進行連續5 天的重復檢測,每天重復檢測4 次,獲得共20個檢測結果。分析CMIA 檢測弱反應性血清標本的精密度。

1.4 使用統計軟件 SPSS 19.0 進行統計學分析 對CMIA 和ELISA 檢測HBsAg 的陽性率差異采用卡方檢驗進行統計分析。

2 結果

2018 年 7 月至 2018 年 10 月期間, 南昌大學第一附屬醫院檢驗科接收申請HBsAg 檢驗的門診就診患者血清標本共計55737 例。其中采用CMIA檢測標本47411 例,檢測結果為有反應性血清標本9957 例,陽性率為21%；采用ELISA 檢測標本8326例, 檢測結果為陽性血清樣本1533 例, 陽性率為18.4%。兩種檢測方法檢測結果經卡方檢驗統計分析,差異具有統計學意義,P=0.032。

CMIA 檢測為HBsAg 弱反應性標本的ELISA法檢測結果，見表1。

183 例CMIA 檢測HBsAg 結果為弱反應性的血清標本,對這些標本采用ELISA 方法進行平行檢測。結果顯示ELISA 檢出的陽性標本數為88 例,陽性率 48.09%（88/183）。

以特異性抗體中和確認試驗作為金標準對此183 例血清標本進行的確認檢測結果顯示, 其中168 例為HBsAg 確認陽性。CMIA 檢測弱反應性HBsAg 標本的陽性預測值為91.80%。ELISA 檢測弱反應性HBsAg 標本的敏感性為52.38%, 但陽性預測值達100%。

表1 183 例HBsAg 弱反應性標本各種方法結果比對

CMIA 檢測值大于或等于0.16IU/mL 的標本,中和確認試驗100%為陽性。

ELISA 檢測為HBsAg 弱反應性標本的CMIA法檢測結果。本研究納入的50 例ELISA 檢測為HBsAg 弱反應性的血清標本,對這些標本采用CMI A 檢測系統進行平行檢測。CMIA 的檢測結果顯示其中47 例為有反應性標本,3 例為非反應性標本。中和確認試驗結果顯示,47 例CMIA 法顯示有反應性的標本HBsAg 均確認為陽性。3 例兩種方法檢測結果不一致的標本均為陰性。47 例HBsAg 檢測結果為有反應性標本的CMIA 檢測值均大于0.16 IU/mL。

根據EP-15A2 文件, CMIA 檢測該弱反應性血清標本的重復性標準差Sr 和變異系數分別為0.010 和5.06%, 中間精密度標準差SI 和變異系數分別為0.011 和5.56%, 均小于廠家聲稱值。見表2。

表2 精密度檢測結果

3 討論

血清中HBsAg 呈現弱反應性的原因有很多種,可能與窗口期、急性感染后期、低水平攜帶者、慢性HBV 感染者、HBV 基因突變或變異者、 合并HCV 和 （或）HDV 感染導致的 HBV 復制和 （或）HBsAg 表達干擾等有關[5]。HBsAg 弱反應性標本的準確及時檢出在提高乙型肝炎窗口期的發現率、流行病學研究、乙型肝炎的預防、保證輸血安全和控制院內感染以及隱匿性乙型肝炎的診斷等方面發揮著舉足輕重的作用[6-10]。

ELISA 對HBsAg 的檢測是一種固相酶聯免疫測定方法,在微孔條上預包被純化的抗乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）,配以酶標記抗體（HBsAb-HRP）,采用夾心法原理檢測人血清（或血漿）中的HBsAg,通過酶與底物發生顏色反應的深淺來判讀HBsAg 的水平。ELISA 是一種定性或半定量的檢測方法。該方法具有檢測靈敏度較高、成本低、對環境污染少等優點,但是亦存在著操作繁瑣、耗時長、影響因素多、質量控制難、低濃度樣本易漏檢、難以定量等缺點[11]。

CMIA 對HBsAg 的檢測是一種將化學發光測定技術與免疫反應相結合的定量分析方法。首先,標本和 HBsAb 包被的順磁微粒子結合,洗滌；第二步,加入吖啶酯標記的HBsAb 的結合物,再次洗滌；最后,加入預觸發液和觸發液,復合物中的吖啶酯被氧化直接發光, 標本中的HBsAg 含量與光學系統所檢測到的相對發光強度(RLU)呈正比。與ELI SA 相比較,該方法具有靈敏度高、可準確定量、影響因素少、重復性好、易于標準化、檢測靈活、自動化程度高等優點[12]。

在本研究中, 重點對HBsAg 弱反應性標本進行分析和討論。對183 例CMIA 檢測HBsAg 呈弱反應性的標本進行ELISA 平行檢測和中和確認試驗檢測,結果顯示CMIA 檢測陽性預測值91.80%；ELISA 檢測敏感性52.38%,陽性預測值100%。對50 例 ELISA 檢測 HBsAg 呈弱反應性標本進行CMIA 平行檢測和中和確認試驗檢測,結果顯示47例標本確認為陽性,3 例兩種方法檢測結果不一致的標本均為陰性。同時,精密度分析結果顯示,CMIA檢測弱反應性血清標本的重復性標準差Sr 和變異系數分別為0.010 和5.06%, 中間精密度標準差SI和變異系數分別為0.011 和5.56%, 均小于廠家聲稱值。由此可以得出,對于HBsAg 弱反應性血清標本,CMIA 不僅具有更高的敏感性,同時也具有很高的可靠性和精密度。故推薦使用CMIA 對HBsAg 弱反應性標本進行檢測,避免漏診和誤診。

對230 例CMIA 檢測為HBsAg 弱反應性的標本進行分段分析的結果顯示, 當HBsAg 檢測值大于或等于0.16IU/mL 時, 中和確認試驗100%為陽性, 檢測結果的特異性達100%。因此, 我們認為CMIA 檢測 HBsAg 濃度大于或等于 0.16IU/mL,假陽性存在的可能性非常小,無需確認試驗即可發出HBsAg 陽性的檢測報告。而當 HBsAg 濃度小于0.16IU/mL, 建議應用中和確認試驗以保證結果的準確性。在本研究中,CMIA 和ELISA 同時檢測HBsAg 為陽性時,確認試驗陽性率 100%。因此,如果實驗室條件不允許對血清標本進行中和確認試驗, 建議嘗試加做ELISA 檢測, 檢測結果若為ELI SA 同時陽性,那么可報告高度懷疑HBsAg 陽性。

HBsAg 檢測有內源性和外源性兩種因素影響導致假陽性的出現。ELISA 檢測的內源性干擾因素包括類風濕因子（RF）、各種補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白,易嗜性抗體、某些特殊的自身抗體、外源性人抗鼠抗體以及交叉反應物質等。外源性干擾因素主要包括標本溶血、振蕩的溫度和時間、試劑的質量的參差不齊、細菌對血清的污染、操作過程中的清洗不徹底,標本離心不充分含有纖維蛋白絲等[13-15]。CMIA 在保證標本離心分離效果,排除嚴重溶血標本等外源性干擾因素后,強調接受小鼠單克隆抗體制劑診斷或治療的患者,樣本中可能出現的人抗小鼠抗體（HAMA）會嚴重影響檢測結果。在排除以上提到的各種因素后,由中和確認試驗對弱反應性標本進行確認。

未確認的標本得出的HBsAg 復檢反應性結果原因有可能為非特異性反應（假反應性）。本研究中,HBsAg 和HBsAb 同時陽性的標本, 確認試驗陽性率降低,也可能是非特異性反應的干擾。在HBV感染的初期或者HBV 感染后的恢復期前期, 對低水平HBsAg 的檢測過程可能被血清標本中某些非特異性結合物質所干擾。建議綜合評估患者HBV感染的各項指標, 包括除HBsAg 外的其他血清學標志物（例如總HBc 抗體）或者HBV DNA 等,也推薦在4～6 周后重新對HBsAg 進行測定, 以確保結果的準確性[16]。

總之,本研究對CMIA 檢測HBsAg 弱反應性血清標本的性能進行了探討,系統的分析了CMIA 檢測到的弱反應性結果的符合率和精密度,對臨床弱反應性結果的處理和結果審核具有一定的參考價值。