熒光定量PCR 法檢測丙肝病毒定量、分型的結(jié)果分析

趙亞娟 ，杜帥格 ，路琳君 ，劉玲

（1.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 平頂山 467000；2.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河南 平頂山 467000）

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎,隨著病情發(fā)展可能引起慢性活動性肝炎,甚至進(jìn)展為肝硬化[1]。有研究表明HCV是肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素, 且丙肝病毒核酸定量(HC V-RNA)與患者預(yù)后密切相關(guān)[2]。目前,臨床針對丙型肝炎患者主要的治療方式是給予干擾素,但在治療過程中需觀察HCV-RNA 在血清中含量的變化,為病情評估提供依據(jù),但有研究指出HCV-RNA 在血清內(nèi)含量較低,認(rèn)為觀察HCV-RNA 在血清中含量的變化這種方法準(zhǔn)確性欠佳[3]。熒光定量PCR 法（FQ-PCR） 在低水平核酸定量檢測中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢,這種檢測方式污染率低,特異度高,能提高檢測精準(zhǔn)度,且容易標(biāo)準(zhǔn)化[4]。為尋找準(zhǔn)確診斷HCV的方法, 本研究對FQ-PCR 法在HCV-RNA 定量、分型檢測中的應(yīng)用價(jià)值及與肝功能的相關(guān)性進(jìn)行分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2018 年 4 月-2019 年 4 月于我院進(jìn)行熒光定量PCR 法檢測HCV-RNA 的患者560 例,其中 HCV-RNA 定量陽性 246 例,有基因分型檢測記錄的112 例,對患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。男 320 例,女 240 例,年齡 23～75 歲,平均 5 1.29±8.95 歲；體質(zhì)指數(shù) 18.5～23.9kg/m2,平均 20.82±0.71kg/m2。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴所有患者經(jīng)FQ-PCR 法檢測確診為 HCV； ⑵抗 HCV 或 HCV-RNA 有 1 項(xiàng)呈陽性；⑶18～80 歲；⑷病例資料完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴心、腦、肺等重要臟器損害；⑵惡性腫瘤；⑶合并其他類型的肝炎,如乙型肝炎、甲型肝炎等；⑷自身免疫性疾??；⑸因精神或體質(zhì)問題無法有效配合試驗(yàn)者。

1.3 方法

1.3.1 FQ-PCR 法檢測主要儀器 SLAN-96P 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀(上海宏石公司)、TGL-16g高速低溫離心機(jī)（珠海黑馬公司）；主要試劑包括上?？迫A生物藥業(yè)股份有限公司提供的丙型肝炎病毒核酸測定試劑盒,泰普生物科學(xué)有限公司提供的丙型肝炎病毒基因分型試劑盒。⑴提取RNA：①取血清200μl,加入40ul 去抑制劑,充分混合后再加入200ul 裂解工作液, 振蕩混勻后瞬時(shí)離心置70℃孵育 10min； ②瞬時(shí)離心后加入 220μl 無水乙醇,振蕩混勻；③離心后將上述液體全部轉(zhuǎn)移至放置專用離心柱的2ml 離心管中；③1100g 離心1min,棄離心管里的廢液；④加入700μl 洗滌液A11 00g離心1min,棄去管內(nèi)液體；⑤加入700μl 洗滌液B 1100g 離心1min, 棄廢液后再2000g 離心 3min 將殘液去除干凈；⑥取出核酸取提柱,放入新的2ml離心管中, 加入50μl 洗脫液至取提柱膜面中央,靜置1min 后離心,離心管中收集的液體即為PCR 反應(yīng)模板。⑵加樣：取配制好的HCV 反應(yīng)液20μl,加入等體積待測模板,離心數(shù)秒后進(jìn)行擴(kuò)增。⑶擴(kuò)增程序：①50℃25min；②94℃2min；③94℃10s,55℃15s,72℃15s,5 個循環(huán)； ④94℃10s,60℃45s,42 個循環(huán)；步驟4 中60℃采集熒光；⑤40℃30s 擴(kuò)增結(jié)束。設(shè)定合適的基線和閾值線, 經(jīng)軟件自動分析出結(jié)果。結(jié)果判斷 測定結(jié)果為0 （無數(shù)值） 的標(biāo)本為HCV-RNA 陰性； 小于 1.0×103IU/ml 報(bào)告低于檢測下限；103～107IU/ml 的樣本按照測定結(jié)果直接報(bào)告。

1.3.2 肝功能指標(biāo) 檢測于入院當(dāng)日采集3ml 空腹靜脈血,3000r/min 離心5min,分離血清,測定并選取觀察血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 、總膽紅素（TBIL）水平。主要儀器全自動生化分析儀為 ADVIA-2400。主要試劑包括 ALT、TBIL、ALB檢測試劑盒均購自北京利德曼生化股份有限公司。ALT、TBIL、ALB 的參考區(qū)間分別為 0～40U/L、0～20umol/L、35～55g/L。

1.4 觀察指標(biāo)與評價(jià)方法 觀察患者HCV-RNA定量與基因分型檢測結(jié)果。于患者入院當(dāng)日檢測肝功能指標(biāo), 包括血清 ALB、ALT、TBIL 水平,以HCV-RNA 定量＜1.0×106IU/ml 為低病毒載量,以HCV-RNA 定量≥1.0×106IU/ml 為高病毒載量,比較不同病毒載量患者的肝功能指標(biāo)。經(jīng)Pearson 線性相關(guān)分析HCV-RNA 定量、 基因分型與丙型肝炎患者肝功能的相關(guān)性。⑴HCV-RNA 陽性評價(jià)：經(jīng)FQ-PCR 法檢測,主要儀器與試劑同上,由專業(yè)檢測人員嚴(yán)格根據(jù)說明書完成操作,以HCV-RNA＞1.0×103IU/ml 視作陽性。⑵HCV-RNA 基因分型：嚴(yán)格按照試劑說明書操作提取RNA, 取各亞型反應(yīng)液加入模板按說明書設(shè)定程序擴(kuò)增, 以CT 值＜25.1 并呈典型S 型曲線為陽性判斷樣本的亞型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法經(jīng)SPSS20.0 軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料用表示,行 t 檢驗(yàn)。經(jīng) Pearson 線性相關(guān)分析HCV-RNA 定量與肝功能的相關(guān)性,相關(guān)性系數(shù)r 越接近-1 或 1,提示相關(guān)性越強(qiáng),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 560 例患者HCV-RNA 定量檢測結(jié)果分析 在560 例患者中,有 314 例（56.07%）患者 HCV-RNA定量檢測呈陰性,246（43.93%）例呈陽性。見表1。

表1 560 例患者HCV-RNA 定量檢測結(jié)果分析[n（%）]

2.2 HCV-RNA 定量陽性、陰性患者的肝功能指標(biāo)比較 HCV-RNA 定量陽性患者血清ALB 水平顯著低于 HCV-RNA 陰性的患者（P＜0.05）,且血清 A LT、TBIL 顯著高于 HCV-RNA 陰性的患者 （P＜0.05）,見表 2。

表2 HCV-RNA 定量陽性、陰性患者的肝功能指標(biāo)比較

表2 HCV-RNA 定量陽性、陰性患者的肝功能指標(biāo)比較

HCV-RNA 定量（IU/ml） n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）陰性陽性314 246 t P 29.83±4.61 24.94±3.25 14.114 0.000 38.51±4.76 55.74±6.19 37.237 0.000 15.31±2.15 25.62±3.78 40.665 0.000

2.3 HCV-RNA 陽性患者低病毒載量、高病毒載量的肝功能指標(biāo)比較 以HCV-RNA 定量＜1.0×106IU/ml 為低病毒載量, 以 HCV-RNA 定量≥1.0×106IU/ml 為高病毒載量,結(jié)果顯示,高病毒載量者的血清ALB 水平顯著低于低病毒載量者,血清AL T、TBIL 顯著高于低病毒載量者（P＜0.05）,見表 3。

2.4 HCV-RNA 定量與肝功能的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson 線性相關(guān)分析提示 HCV-RNA 與血清ALT、TBIL 呈正相關(guān)（r=0.441、0.625,P＜0.05）,與 AL B 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.774,P＜0.05）。

表3 HCV-RNA 陽性患者低病毒載量、高病毒載量的肝功能指標(biāo)比較

表3 HCV-RNA 陽性患者低病毒載量、高病毒載量的肝功能指標(biāo)比較

HCV-RNA 定量（IU/ml） n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）低病毒載量高病毒載量138 108 t P 27.36±2.53 22.81±2.98 12.942 0.000 39.95±3.71 52.39±5.03 22.318 0.000 14.92±2.03 23.91±3.35 26.015 0.000

2.5 112 例患者基因分型檢測結(jié)果及肝功能指標(biāo)分析 在 112 例患者中,1b 型 83（74.11%）例,非 1b型 29 （25.89%） 例。1b 型與非 1b 型患者的血清ALB、ALT、TBIL 水平比較無顯著差異 （P＞0.05）,見表4。

表4 HCV-RNA 定量與肝功能的相關(guān)性分析

表4 HCV-RNA 定量與肝功能的相關(guān)性分析

HCV-RNA 基因分型 n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）1b 型非1b 型83 29 t P 28.33±4.76 27.19±4.03 1.153 0.252 47.15±4.13 45.59±5.07 1.648 0.102 21.59±4.54 23.47±4.48 1.926 0.057

3 討論

目前, 臨床針對HCV-RNA 的檢測方法較多,但檢測效果不盡相同,如分枝DNA(bDNA)技術(shù)操作簡單、穩(wěn)定性良好,但其定量范圍、敏感度欠佳[5]。有研究表明HCV-RNA 在血清中表達(dá)量較少,且變化范圍大,臨床必須選擇一種敏感度、特異度、準(zhǔn)確率高的方式予以測定,提高檢測效果[6]。有研究指出抗HCV 檢測僅能反映既往感染或HCV 感染,無法完全作為丙型肝炎診斷的依據(jù)[7]。FQ-PCR 法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法的缺陷,能降低污染率,且操作簡單,尤其適用于定量意義大的指標(biāo)[8]。這種檢測方式通過系統(tǒng)熒光曲線明確循環(huán)數(shù)量, 能確保PCR 反應(yīng)呈對數(shù)期狀態(tài),提高檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性[9]。

通過分析患者的HCV-RNA 基因分型,提示以1b 型居多,與既往研究結(jié)論基本吻合[10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HCV 病毒分型存在地域性特征,1a 型大多集中在歐美國家,1b、2a 型則集中于亞洲國家,4 型集中于中東、北非地區(qū),這為本研究結(jié)論提供了理論支持[11-12]。本研究納入的均為中國居民,基因分型以1b為主。我國關(guān)于HCV4 型的報(bào)道非常少見,在廣東地區(qū)可能存在HCV4 型病例,原因在于該地區(qū)屬于沿海開放城市,國際交流相對較多,經(jīng)常出入外籍人士[13,14]。FQ-PCR 法可通過擴(kuò)增特異性HCV 基因片段測定核苷酸序列,從而對HCV-RNA 基因分型進(jìn)行檢測, 容易實(shí)現(xiàn)HCV-RNA 檢測的標(biāo)準(zhǔn)化,檢測準(zhǔn)確性較高。

肝功能損害在丙型肝炎患者中比較常見,血清ALB、ALT、TBIL 水平是評估肝功能受損程度的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)在丙型肝炎患者中,血清 ALB 減低較為常見,且患者血清 ALT、TBIL 水平均高于正常人[15,16]。筆者發(fā)現(xiàn) HCV-RNA 定量陽性者的血清ALT、TBIL 水平高于陰性者,ALB 水平低于陰性者, 高病毒載量者的血清ALB 水平顯著低于低病毒載量者, 血清ALT、TBIL 水平高于低病毒載量者,經(jīng) Pearson 線性相關(guān)分析證實(shí)隨著HCV-RNA 定量越高,患者的肝功能損害越重,血清ALB、ALT、TBIL 表達(dá)異常越明顯。因此,臨床醫(yī)師可通過測定HCV -RNA 定量對患者肝功能受損程度進(jìn)行預(yù)測,制定針對性的治療方案。本研究提示不同基因分型患者的肝功能指標(biāo)無明顯差異,提示基因分型可能無法預(yù)測患者的肝功能受損程度,未來將對此進(jìn)一步論證。

綜上,FQ-PCR 法在HCV-RNA 定量與基因分型檢測中應(yīng)用效果較好,研究顯示HCV-RNA 定量與血清ALB、ALT、TBIL 水平具有較大相關(guān)性,臨床需對此引起重視。