污染菌對血培養及血流感染三聯檢檢測影響的評估研究

章婷，杜小文

（1.萬年縣中醫院檢驗科；江西 萬年 335500）

血培養是血流感染診斷的金標準,但采血過程易受到污染。一個由CAP 主導的影響重大的研究，發現來自美國640 家醫院497134 例血培養標本污染率平均污染率為2.5%, 常見污染菌為凝固酶陰性葡萄球菌、 微球菌、α-溶血草綠色鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌、棒狀桿菌以及芽孢桿菌[1,2]。

污染菌產生的假陽性導致臨床面對報告單的迷茫,也由于無對應的癥狀和治療容易引起患者的抱怨和投訴。血培養污染的原因主要有：采血人員無菌意識差；采血環境不達標，穿刺間空氣消毒不合格；皮膚消毒不規范不徹底；培養瓶瓶塞穿刺區消毒不規范不徹底,且采血的皮膚消毒過程不可能做到無菌，因為約20%的細菌隱藏在汗液的毛孔、毛囊及表皮和真皮深層的其它結構中[3]，目前的醫療環境, 這些問題是很難在短時間內得到改善的,而PG、LPS 和BG 檢測是目前檢測血流感染的新的血清學方法,通過這3 個標志物的檢測可以區分革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌引起的血流感染，具有早期診斷以及連續檢測等特點[4-6]，但是采血過程引入的污染菌是否同樣會對其造成干擾,尚無人研究。本研究通過制備模擬臨床采血污染樣本,進行血培養和血流感染三聯檢的檢測及污染樣本菌繁殖情況分析,對培養法和生化檢測常見污染菌的干擾情況進行評估,為臨床使用相關方法學檢測應注意的事項提供參考。

1 對象與方法

1.1 菌株 共分為 3 類。Ⅰ.G+表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis ATCC12228、 葡萄球菌人亞種Staphylococcus hominis ATPQ15020、藤黃微球菌Micrococcus luteusCMCC(B)28001、血鏈球菌Streptococcus sanguis ATCC10556、 痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes ATCC6919、假白喉棒狀桿菌Corynebacterium pseudodiphtheriticum ATCC10 700、 解淀粉芽孢桿菌 Bacillus amyloliquefaciensATJD161125 Ⅱ.G-鮑曼不動桿菌 Acinetobacter baumannii ATCC19606,洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia ATCC25608, 嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia ATCC17666；Ⅲ.真 菌煙曲霉Aspergillus fumigatus CICC40167、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii ATCC18502，所有標 2.試劑及儀器：生物安全柜 1300 SERIES A2,購自Thermo Scientific；CO2培養箱 HERACELL 150I,購自 Thermo Scientific；厭氧產氣袋 AnaeroGen 2.5 L，購自Thermo Scientific，比濁儀 PLASTIC plus，購自生物梅里埃；血球計數板，采購自上海求精生化試劑儀器有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自山東齊都藥業有限公司；手工血培養瓶、沙保羅瓊脂平板、血瓊脂平板，購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；血流感染三聯檢革蘭氏陽性細菌肽聚糖檢測試劑盒（顯色法）、革蘭氏陰性細菌內毒素檢測試劑盒（顯色法）、真菌（1-3）-β-D-葡聚糖檢測試劑盒（顯色法）來自于鄭州安圖生物工程股份有限公司，檢測儀器為全自動酶標分析儀， 購置自安圖實驗儀器（鄭州）有限公司。

1.3 檢測方法 ⑴菌液制備 提前將菌株活化，轉接第二代備用。用接種環挑取菌落，用0.9%氯化鈉注射液將G+菌和G-菌在比濁管中進行稀釋，先用比濁儀制備成0.5 麥氏菌液（濃度按照108CFU/ml 進行計算）， 再用0.9%氯化鈉 注射液稀釋到102CFU/ml(H)和 101CFU/ml(L)兩個濃度（取 102CFU/ml 菌懸液100μl 涂血平板計數； 煙曲霉以及宛氏擬青霉制備成分生孢子懸濁液后用血球計數板進行計數， 用0.9%氯化鈉注射液稀釋到5*102CFU/ml(H)和 5*101CFU/ml(L)兩個濃度，取 5*102CFU/ml 菌懸液100μl 涂平板菌落計數。⑵模擬血液污染菌樣本制備 新鮮血液來自8 名志愿者， 近期均無發熱等感染癥狀，近一周未服用抗菌藥物。嚴格按照規范采血要求將血液抽取到肝素抗凝采血管中， 每管 5ml， 立即吸取 200μl 102CFU/ml、101CFU/ml 菌液分別加入到一管全血中, 接菌后輕微顛倒混勻8～10 次，每個菌高、低濃度各6 個平行，高濃度采血管編號H1～H6、 低濃度采血管編號L1～L6。⑶檢測 取 H1、H2 采血管中樣本分別加入兩個血培養瓶中, 取H3、H4 采血管中樣品離心后吸取上清立即進行進行PG、LPS、BG 的檢測，剩余的樣本顛倒混勻后與H5、H6 分成兩組， 分別放置室溫和2℃～8℃24h 后離心取上清再次進行 PG、LPS、BG 的檢測,并涂板進行菌落計數，每個樣本涂3 個平板。加低濃度菌液的血液樣本按照高濃度樣本進行相同處理。以不加菌的血液為陰性對照。除血液采集及離心外, 其余操作均在潔凈條件下進行。⑷結果判讀及統計 血培養和PG、LPS、BG 檢測的操作和結果判讀嚴格按照試劑和儀器說明書進行。血培養瓶分別對應放入普通培養箱及CO2培養箱中進行培養，5～8 天內觀察培養結果；PG、LPS、BG 三項檢測流程：全血樣本 4000r/min 離心10min，取上清作為三項的檢測樣本，取三項待檢樣本按照產品試劑盒說明書操作進行實驗并回算結果。分別對血培養結果、 平板菌落計數結果及PG、LPS、BG 檢測結果進行統計。

2 結果

2.1 模擬樣本含菌量制備得到的模擬血污染菌樣本的含菌量高濃度約在5～40CFU 每份樣本， 低濃度約在0～5CFU 每份樣本，符合臨床實際的污染菌數量[7]（表 1）。

表1 樣本制備前菌液涂板菌落計數結果

2.2 血培養及血流感染三聯檢檢測結果分析 血培養模擬樣本高濃度均檢出陽性,低濃度除痤瘡丙酸桿菌和假白喉棒狀桿菌外也檢出為陽性，而PG、LPS 和 BG 檢測放置 0h、2～8℃24h 與室溫 24h 樣本均為陰性，且檢測值均低于檢出限，和陰性樣本對照無差異。說明這些污染菌在常規污染量會造成血培養的假陽性，而對PG、LPS 和BG 檢測無干擾。見表 2。

2.3 樣本菌落計數 放置2～8℃和室溫24h 后涂板計數，發現各菌株均未出現大量繁殖，由于計數時平板上菌落過少,計數結果不是一個特別精確的數值，但可以確定的是，每個樣本中的菌落總數進本維持在原數量的0～10 倍范圍內（表3）。而痤瘡丙酸桿菌室溫和2～8℃樣本、 血鏈球菌2～8℃樣本涂板未見菌生長,可能和血液在體外不能維持痤瘡丙酸桿菌生長所需的嚴格厭氧環境相關, 血鏈球菌2～8℃不生長應為其不耐低溫，導致菌死亡。這說明血液并不是一個適宜菌繁殖的環境,菌株在血液中并未出現明顯的繁殖和代謝， 所以PG、LPS 和BG檢測為陰性是一個正常的結果。

3 討論

PG、LPS、BG 分別是 G+、G-和真菌細胞壁上的特異性多糖,其含量的增高同血流感染的發生呈高度相關。在體外診斷中，利用這三項標志物同鱟變形細胞產物或昆蟲血淋巴中酶原級聯體系的反應而檢測這三種標志物在血液中的變化,也是血流感染和侵襲性真菌病診斷的一個重要的微生物學標準[8]，其中LPS 和BG 檢測近年來已發展成為臨床用于血流感染較為廣泛的指標。PG、LPS、BG 檢測的樣本是血清或血漿,檢測時間一般相對于血培養較為滯后，多在采集后2～8 個小時內進行檢測，這可能給樣本中的污染菌一個繁殖的時間,而從反應的標志物來說，污染菌和目標菌并無差異，所以說我們研究污染菌對此方法學的干擾是十分必要的。

表2 血培養結果及PG、LPS、BG 檢測結果

表3 模擬臨床采血樣本2-8℃24h 及室溫24h 平板菌落計數結果

本研究通過制備模擬臨床采血污染樣本，并對血培養和血流感染三聯檢的檢測結果進行比較,可以看出正常的采血污染確實會造成血培養的假陽性,但是卻不會對PG、LPS 和BG 檢測產生干擾。有文獻顯示,多種菌血培養的陽性結果意義很難界定，腸球菌、不動桿菌和其它非發酵革蘭氏陰性桿菌在60%～70%的病例中是有意義的，但也有25%～30%意義是不明確的； 草綠色鏈球菌僅30%有意義；凝固酶陰性葡萄球菌更是挑戰，盡管只有10%～15%有臨床意義，但它檢出相對多，通常比其它菌的三倍還要多[9]。而一項關于醫院霉菌相與住院病人感染相關性的研究發現,青霉在環境塵粒樣本中的分離概率是51.5%，在手術病人傷口分泌液分離菌株中占比40.4%[7]。臨床真正的微生物血流感染，微生物在血液中是不斷地生長和衰亡的循環過程，而當人體致病時，機體的免疫系統也處于一個失衡狀態，代謝產生的肽聚糖、內毒素或葡聚糖速率超過了機體的清除速率[10]，濃度隨著疾病進程的不同時期變化，呈現一個先升高，到達高點，再下降最終徹底康復后回復平衡的狀態,因此臨床真正的血流感染肽聚糖、內毒素或葡聚糖檢測結果為陽性，且檢測值的高低和感染的程度相關，而血液離體后,體內的免疫細胞還會在一段時間內維持活性,污染菌入血后受人體血液系統的免疫系統影響,很快被吞噬殺死或者處于靜態存活，不能持續繁殖，且菌量很低且不持續， 產生的特異性多糖片段被溶菌酶等進一步分解成無法識別的片段[11]，因此不會造成血檢三項檢測干擾， 但這些污染菌如果進入血培養瓶,血培養瓶豐富的培養基質會讓其迅速生長繁殖,血瓶的內部環境也會裂解一部分免疫細胞,滅活一部分免疫因子，因而血培養為陽性。因此，傳統的血培養無法規避也無法區分污染菌， 而PG、LPS 和BG 檢測可以很好的避免污染菌造成的干擾，提高血流感染檢測的準確率。