AMH 基因多態性與PCOS 發病的關系探討

祁彥萍，楊瑞，楊建敏

（鄭州大學附屬醫院南陽市中心醫院婦產科，河南 南陽473000）

抗苗勒管激素（AMH）是轉化生長因子β 超家族中的一員,是由卵巢顆粒細胞分泌的苗勒管抑制物質。其血清水平高低可代表不同的卵巢儲備功[1]。有研究報道[2]多囊卵巢綜合癥（PCOS）患者血清AMH 水平顯著升高,充分說明,AMH 表達水平在卵巢儲備功能不同患者體內存在差異。由此提醒研究者AMH 基因多態性與PCOS 發病機制具有一定的聯系[3]。本研究通過檢測PCOS 患者組與排卵正常的對照組 GT 基因型、BMI、PRL、P、T、FSH、E2及上述指標與PCOS 的相關性差異,并同時研究A MH 基因多態性與患者體質重指數（BMI）、GT 基因型、BMI、PRL、P、T、FSH、E2 進行比較,以探討 AMH基因多態性與PCOS 患者代謝及激素紊亂之間的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2015 年 5 月-2017 年 5月確診的 PCOS 患者 100 例（PCOS 組）、正常排卵婦女 100 例（對照組）。PCOS 組，年齡 24～38 歲，平均 29.1±3.5 歲，體質量指數（BMI）24.2±2.3kg/m2。對照組,年齡 22～38 歲,平均 28.7±3.1 歲,BMI 21.8±1.8 kg/m2。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準[4]⑴患者年齡 19～38 歲；⑵PCOS組患者嚴格按照2003 年鹿特丹標準選取：①稀發排卵或無排卵；②高雄激素臨床表現和(或)高雄激素血癥；③一側或雙側卵巢多囊樣改變,上述3 條中符合2 條；⑶對照組婦女為正常排卵的健康自愿者；⑷本研究實施前與患者簽署保密協議、知情同意書。

1.2.2 排除標準：⑴伴有嚴重的血液系統疾病；⑵感染性疾病；⑶腫瘤疾病；⑷合并其他類型疾病。

1.3 E2、PRL、FSH、P、T 檢測方法 抽取患者月經第3 天的空腹靜脈血進行血清雌激素（E2）、催乳素（PRL）、卵泡雌激素（FSH）、孕酮（P）、睪酮（T）測定，采用化學發光免疫分析法，所需要的試劑盒購自瑞士羅氏公司。

1.4 PCR 方法 ⑴總DNA 的提取：采用試劑盒提取DNA 方法,并嚴格按照說明書進行(試劑盒由天根生化科技有限公司提供)；⑵AMH 目的基因序列PCR 擴增：PCR 反應總體積 25ul，AMHF 引物序列如下：上游5 一CCTI'CCACTCGGCTCGGCTCACTTA-3’，下游 TCCTCCAGGTGTAGGACCAC-5’，擴增片段長度430bp AMH 擴增反應程序為94℃預變性 2 分鐘，94℃變性 3O 秒，55℃退火 30 秒，72℃延伸30 秒,從變性至延伸共3O 個熱循環后，再72℃延伸，12℃保存。反應完成后，取5ul 上樣于2%瓊脂糖凝膠孔電泳35～35min 后,在紫外透射／凝膠成像儀上觀察PCR 產物的擴增情況。⑶PCR 產物純化：嚴格按照Milli.pore 公司96 純化板操作流程操作。

1.5 統計學方法 統計軟件采用SPSS16.0，采用均數±標準差進行統計描述，組間比較采用t 檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic 回歸分析法；P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組的AMH 基因型、 等位基因頻率比較PCOS 組的GT 基因型45.00%，顯著的高于對照組的 25.00%（P＜0.05），PCOS 組的等位基因 T、G 頻率與對照組比較差異不具有統計學意義 (P＞0.05)；見表1。

2.2 兩組的年齡、BMI、 性激素水平比較 PCOS 組和對照組的年齡、E2 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；PCOS 組的 BMI、PRL、P、T 的水平顯著的高于對照組（P＜0.05），PCOS 組的 FSH 水平顯著的低于對照組（P＜0.05）；見表 2。

2.3 多因素分析結果 Logistic 回歸分析結果顯示：PRL、P、T 的水平、AMH 基因中 GT 基因型增高、FSH 水平降低是并發PCOS 的獨立危險因素 (P＜0.05)；見表 3。

3 討論

PCOS 是一種復雜的內分泌及代謝性疾病，增加肥胖癥、動脈硬化、心血管疾病及妊娠期糖尿病的風險[5]。有研究表明[6]在 PCOS 患者中，約 30%妊娠期糖尿病患者產后多發展為2 型糖尿病。同時，PCOS 引起胰島素抵抗會引發一系列高胰島素血癥所伴隨的臨床癥狀如高雄激素血癥、代謝紊亂、生殖紊亂、多毛、痤瘡等。研究者認為[7]胰島素抵抗是PCOS 的始發因素和中心環節。近年來有學者研究PCOS 基因水平的發病機制, 發現PCOS 的發病與AMH 基因多態性有關。AMH 是一種糖蛋白二聚體由二硫鍵連接形成[8]。AMH 需要與受體結合進行相應的信息傳遞,實現生物學效應。有I、II、III 三種受體，其中起主要作用的是AMHII 受體，其大部分由顆粒細胞表達，少量由卵泡膜細胞表達。通過連接AMHII 受體和AMH 實現AMH 的信息傳遞過程，具有控制卵泡生長和發育的功能，主要通過抑制卵泡細胞的起始和循環募集實現的[9]。由于相關研究發現[10]在IVF-ET 過程中，AMH 的表達不受促性腺激素作用的影響,能較獨立反應卵巢儲蓄功能，排除其他因素的影響。

近年來，很多學者開始從基因水平研究PCOS的發病機制。周偉偉等研究發現[11]AMH 基因多態性與PCOS 發病機制相關，有研究通過給予外源性的AMH 發現，芳香酶mRNA 水平顯著降低，可進一步抑制孕酮、睪酮的合成，下調LH 水平，最終抑制卵泡的形成過程，以此參與PCOS 的發生發展過程。其對PCOS 患者AMH、AMHII 受體的基因型多樣性與PCOS 發病機制密切相關。本研究結果證實了學者認為AMH 基因多態性與PCOS 發病相關性的觀點，且研究結果發現PCOS 組的GT 基因型45.00%顯著的高于對照組的 25.00%（P＜0.05）,PC OS 組的等位基因T、G 頻率與對照組比較差異不具有統計學意義（P＞0.05）；這與孫娜等學者報道研究結果一致[12]，其中 G/T 表型的患者中 BMI、LH、T水平顯著高于G/G 和T/T 表型的PSOS 患者。說明G/T 基因型能增加PCOS 患者并發肥胖、高雄激素血癥。其原因主要是由于代謝紊亂導致的LH/FSH比值異常，合成雄激素的關鍵酶-P450-17-α 碳酸酶活性增強從而使血清T 水平明顯升高。證實PCOS 患者AMH 基因型多態性不僅與PCOS 發病機制密切相關還與其病理生理學研究相吻合。

表1 兩組患者的AMH 基因型、等位基因頻率比較[n（%）]

表 2 兩組的年齡、BMI、性激素水平比較

表 2 兩組的年齡、BMI、性激素水平比較

組別n 年齡（歲）BMI（kg/m2）29.1±3.5 28.7±3.1 1.408 0.296 E2（pg/ml） PRL（ng/ml） FSH（/mIUml） P（ng/ml） T（ng/dl）PCOS 組對照組t 值P 值100 100 24.2±2.3 21.8±1.8 10.064＜0.001 51.09±9.41 53.00±10.86 1.628 0.105 14.86±2.62 12.04±2.21 10.076＜0.001 5.57±0.92 6.83±1.22 10.099＜0.001 0.73±0.14 0.61±0.16 6.913＜0.001 59.66±11.72 28.43±5.09 29.934＜0.001

表3 Logistic 回歸分析結果

本研究結果顯示PCOS 患者FSH 水平下降，其原因可能是，PCOS 患者主要的臨床表現月經不調和不孕主要是由于卵泡發育障礙引起的[13]。PCOS 甾體激素代謝紊亂是PCOS 病理生理學變化的基礎。FSH 調節卵巢顆粒細胞芳香化酶活性受阻，雌二醇合成相對低下。有研究表明[14,15]PCOS 患者卵巢內的芳香化酶活性正常甚至亢進使雌二醇的合成增加。由于FSH 與雌二醇之間存在負反饋調節機制，PCOS 合成雌二醇能力亢進反饋性抑制FSH 的合成。與本研究結果一致。提示 PCOS 患者卵巢本身的雌激素合成亢進負反饋引起FSH 降低是導致PCOS 相關臨床癥狀的始發因素。同時本研究結果顯示 PRL、P、T 的水平、AMH 基因中 GT 基因型增高、卵泡雌激素（FSH）水平降低是并發PC OS 的獨立危險因素（P＜0.05）。提示 PRL、P、T 的水平、AMH 基因中GT 基因型增高、卵泡雌激素(FSH)水平降低是并發PCOS 的獨立危險因素，上述指標的變化應警惕PCOS 并及時診治。

綜上所述，AMH 基因型中G/T 將會加大PCOS的發病風險。其發病可能不受年齡的影響,需進一步擴大臨床樣本以研究年齡對PCOS 發病的影響。