PCR 快速檢測堅果及籽類制品中的霉菌

袁愛華 ，駱瑜 ，王維亞 ，林志超

（1.南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330096；2.南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室, 江西 南昌 330096）

堅果及籽類制品包含品種多達20 多種，其口味獨特，營養價值豐富，含有蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、微量元素、膳食纖維和多種不飽和脂肪酸。該類產品具有抗氧化、軟化血管、抑制肥胖和降低糖尿病發病率等作用[1,2]。隨著人們生活條件的改善和保健意識的提升,對堅果與籽類制品的需求量日見增長。但堅果與籽類制品在生產、儲存及運輸時極易受到霉菌的污染,食品的深加工和網購的流行，更讓產品質量難以保證。歐盟食品和飼料快速警報系統（RASFF）的報告數據顯示，真菌毒素是堅果和籽類食品中報告頻率最高的有害物質[3,4]。真菌毒素是霉菌產生的有害次生代謝產物[5]，食源性霉菌已成為食品安全風險的重要來源之一。霉菌的檢測主要有傳統培養法、生化檢測法、代謝學檢測法、流式細胞技術法、實時光電微生物檢測法及分子生物學檢測法等[6]。傳統培養法作為國標金標準，存在檢測時間長、操作復雜及工作量大的缺點。隨著現代科學技術的發展和對監管時限要求的提高, 快速高效的檢測方法逐漸受到廣泛關注。PCR 檢測技術以其快速、簡便、準確等優點在國際上得到了廣泛的認可[7]，被譽為現代快速方法的金標準。在霉菌檢測方面，預計PCR 檢測比傳統培養方法快4～6d。由于霉菌PCR 檢測技術起步較晚，加之霉菌生理和形態的多樣化和復雜性，及食品成分的基質效應也可能影響菌體生長和PCR 擴增[8],致使霉菌PCR 檢測技術應用并不廣泛。黑曲霉菌是增菌培養基的霉菌質控菌珠,黃曲霉菌和青霉菌是農產品貯存過程中出現的主要致腐菌[9-12]。為提高堅果及籽類制品中霉菌的檢測時效,本研究以黑曲霉、青霉菌、黃曲霉菌為實驗菌珠,通過改良前增菌培養，優化擴增條件，建立適用于堅果及籽類制品的霉菌PCR 檢測技術, 同時對本市抽樣的檢品進行檢測, 并與傳統分離培養法進行對比研究，確認方法學的適用性和有效性，實現對堅果及籽類制品中霉菌的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黑曲霉菌珠 CMCC（F）98003（定量1000～2000 CFU/顆,購自北京三藥科技開發公司），黃曲霉菌、青霉菌為本實驗室保存；花生仁、葵花子、瓜子、核桃、花生等為超市自購；68 批檢品為2019 年抽樣樣品。

1.2 儀器與試劑 西班牙BioII-Advance4 生物安全柜、上海一恒THZ－100 恒溫培養搖床、HIRYAM AHVA-85 高壓蒸汽滅菌鍋、 尼康XS212 顯微鏡、杜邦BAX SystemQ7 全自動病原微生物檢測系統、法國Interscience BagMixer400s 均質器、 北京六一生物科技DYY-6C 型電泳儀、 上海勤翔科學儀器1880 凝膠成像系統。酪蛋白葡萄糖肉湯、馬鈴薯液體培養基（含氯霉素）、察氏液體培養基、麥芽汁培養基、麥芽浸粉、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基( PDA)均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司，孟加拉紅購自北京陸橋技術有限責任公司，馬鈴薯汁（自制，取去皮馬鈴薯200 g 切成小塊，加水1000ml，煮沸 20min，紗布過濾，備用）。杜邦霉菌檢測試劑盒購自Hygiena LLC。氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵，均為化學純或分析純。

1.3 改良培養基的配置 改良酪蛋白葡萄糖肉湯配方：酪蛋白葡萄糖肉湯加馬鈴薯（200g/1000ml）（簡稱酪改），改良麥芽汁培養基配方：麥芽汁培養基加氯化鈉5g/1000ml（簡稱麥改），改良馬鈴薯液體培養基配方：馬鈴薯液體培養基加磷酸氫二鉀1 g/1000ml、 硫酸鎂 0.5g/1000ml、 氯化鉀 0.5g/1000 ml、硫酸亞鐵 0.01g/1000ml（簡稱馬改），改良察氏液體培養基配方：察氏液體培養基加馬鈴薯（200g/1000ml）（簡稱察改），以上培養基高壓滅菌后按每管1ml 分裝于帶分裂珠的分裂管， 所有培養基均為新鮮配制。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液的制備 將定量黑曲霉菌株用配套菌株復溶液活化后以0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，用移液器充分吹打使孢子呈均勻分散狀態,采用血球計數板對孢子計數后進行梯度稀釋,使孢子懸液濃度約為 100 CFU/ml、200 CFU/ml 備用。黃曲霉菌、青霉菌以0.9%無菌氯化鈉溶液制備后與黑曲霉菌混勻，同方法進行梯度稀釋，使混合孢子懸液濃度約為 100 CFU/ml、200 CFU/ml 備用。

1.4.2 前增菌的優化 對5 種霉菌常用基礎培養基進行改良，以相互缺少成分為變量，分別按組合排列方式添加至原培養基中, 得到改良培養基共51種, 通過對30 h 內黑曲霉菌肉眼可見菌絲球的培養基進行36 h 干質量對比和形態分析, 篩選出適合霉菌快速增菌的優勢改良培養基：酪改、麥改、察改、馬改[13]，并對此4 種優勢改良培養基進行堅果及籽類制品中霉菌的PCR 檢測。

1.4.3 PCR 體系的優化 通過預實驗觀察食品基質加入培養基的狀態發現，花生仁、核桃仁等脂質含量高和出漿高的堅果與籽類易使培養基渾濁，易造成檢測結果假陰性，為減少基質對DNA 的提取和PCR 擴增的影響,樣品均質后應靜止5min 后取上清液作增菌培養。DNA 提取液和PCR 引物及反應體系均使用杜邦BAX system 霉菌試劑盒組分及方案。確定 PCR 反應條件：94 ℃預變性 2min，1個循環；保持退火溫度56 ℃ 45S，72 ℃延伸120S，共擴增38 個循環,可減少非特異性產物的形成，用杜邦BAX SystemQ7 擴增并讀取結果后，將擴增產物在1 .50 %瓊脂糖凝膠電泳上分離驗證。

1.4.4 敏感性實驗 通過預實驗后, 對人工污染樣品檢測限度進行確認。取黑曲霉菌及混合備用孢子懸液按10 倍比例分別對經檢測無菌的花生仁進行人工污染,使各霉菌懸液在花生仁中的含量分別約為10 CFU/g、20 CFU/g。黑曲霉菌和混合霉菌污染的花生仁各取10g 放置到90ml 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋, 均質器拍打30 S 制成均勻的懸混液備檢。各取 200μl 懸混液至 1ml 酪改、 馬改、麥改、察改分裂管中增菌,28 ℃、160r/min 恒溫培養搖床培養26h 增菌。增菌液按杜邦BAX 霉菌試劑盒說明進行DNA 的核酸提取,取50μL 裂解物按優化后的擴增條件進行擴增讀取結果，建立PCR 方法。同時,對以上各樣品按國家標準GB4789.15-2016[14]霉菌的培養方法各取1ml 至平皿(n=2)進行驗證。

1.4.5 樣品前處理的影響 因GB19300-2014《食品安全國家標準堅果與籽類食品》[15]中僅對過氧化值和酸價的檢測明確了樣品前處理方式,對霉菌的檢測未明確樣品前處理方式。考慮嗑食和剝食的食用方式與外殼的接觸程度,及堅果類食品的外殼前處理方式對霉菌檢測結果的影響,分別選取可嗑食的葵花子、瓜子各1 份和剝食的核桃、花生各2 份置80%濕度環境，暴露受潮20 d，對以上樣品進行去殼和不去殼處理后， 常規取樣均質器拍擊后用已建立的PCR 和傳統培養法（n=2)進行檢測與驗證。

1.4.6 實際樣品檢測 對68 份日常監督抽樣樣品進行PCR 檢測與傳統培養法驗證。各取10g 放置到90ml0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋,均質器拍打30S制成均勻的懸混液備檢。各取200μl 備檢懸混液,放置到1ml 酪改、馬改、察改分裂管中增菌，28℃、160r/min 恒溫培養搖床培養26h 后按PCR 法進行檢測。同時,對以上各樣品按國家標準GB 4789.15～2016[14]霉菌的培養方法進行檢驗驗證。

1.4.7 數據處理 采用SPSS20.0 軟件進行分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 敏感性實驗 由圖1 可知,杜邦BAX SystemQ7檢測結果除空白陰性外，麥2 結果也是陰性，說明麥2 未檢出；從電泳圖可以發現所有內標陽性和檢測結果條帶清晰，未見其它非特異性擴增產物，檢測項目除麥2 和空白陰性外, 其它檢測結果均陽性,與杜邦BAX SystemQ7 檢測結果一致。對以上污染樣品用孟加拉紅培養5d 計數，黑曲霉菌液分別為 9 CFU/g、20 CFU/g，混合菌液分別為 10 CFU/g、18 CFU/g。由以上結果可知，除在麥芽汁改良培養基26h 增菌，檢測結果不穩定外，酪改、馬改、察改對于黑曲霉菌及混合霉菌污染樣的檢測限度均能達到10 CFU/g,檢測限度優于試劑盒原非合并樣品檢測法；和杜邦BAXsystem 中針對酸奶、玉米粉和嬰兒配方奶粉中酵母菌和霉菌的檢測時間對比，檢測時效縮短18h。考慮改良麥芽汁培養基在10 CFU/g 檢測限度時不穩定，故只用酪改、馬改、察改作前增菌培養基進行實際樣品驗證。

圖1 人工污染樣品敏感性實驗結果

2.2 樣品前處理的影響 霉菌菌絲雖有可穿透食品的物理三維空間性質，但由檢測結果可知，核桃的霉菌PCR 檢測結果, 未去殼的核桃四種增菌液中檢測均陰性,而去殼的核桃四種增菌液中檢測結果均為陽性,對照培養法的結果可見未去殼核桃中霉菌結果分別為7 CFU/g、5 CFU/g，去殼核桃中霉菌結果分別為11 CFU/g、13 CFU/g。未去殼的花生和去殼的花生四種增菌液中PCR 檢測結果均為陽性,對照培養法的結果可見未去殼花生中霉菌結果分別為22 CFU/g、35 CFU/g，去殼花生中霉菌結果為 29 CFU/g、39 CFU/g。未去殼核桃、花生與去殼核桃、花生培養法結果均有顯著性差異，說明去殼后檢測結果更具代表性。這與花生和核桃類堅果易從可食部分滋生霉菌有關,也與此類堅果外殼厚重而營養缺乏,霉菌滋生速度較慢但占取樣比重較大,而造成去殼和未去殼前處理方式對檢測結果影響較大。嗑食類的未去殼和去殼的葵花籽和瓜子四種增菌液中霉菌PCR 檢測均陰性, 對照培養法的結果可見葵花籽未去殼的結果1 CFU/g, 去殼后結果為＜1 CFU/g,未去殼和去殼的瓜子結果均為＜1 CFU/g，結果無顯著性差異。葵花籽和瓜子等籽類主要食用方式為嗑食，易食用到外殼污染菌，而剝食類與外殼相對接觸少,因此建議堅果及籽類制品中對微生物的檢測也應該明確剝食類帶殼堅果應剝去外殼，再取樣檢測。

2.3 實際樣品檢測 檢測結果表明，PCR 檢出5 份,檢出率為7.35%；培養法檢出8 份,檢出率為11.76%,共有3 批結果低于10 CFU/g,所以PCR 未檢出，按培養法可判定1 例不合格, 不合格率為1.47%。說明PCR 實驗的敏感性和特異性符合方法學預期，可作為快速檢測方法。

3 討論

由于霉菌孢子可以在空氣中長時間存活，并可通過空氣傳播給其他物質，因此它們無處不在。霉菌污染產生的真菌毒素給人們的生活和健康帶來了極大的危害,其污染造成的損失一直是人們關注的焦點。近年來，世界上許多國家都制定了各種食品中霉菌的限量標準，同時，為加強對霉菌檢測技術的研究, 不斷提出改進檢測技術的新思路。PCR 技術是對特定DNA 片段的擴增，在食源性微生物檢測中起著重要作用。本實驗通過改良前增菌時間和優化擴增條件,研究堅果及籽類制品的基質效應對霉菌PCR 檢測的影響, 優化建立適用于堅果及籽類制品的PCR 檢測方法。該檢測方案較杜邦BAXsystem 中針對酸奶、 玉米粉和嬰兒配方奶粉中酵母菌和霉菌的檢測方案時間縮短18h，檢測限可達10 CFU/g。經驗證，敏感性和特異性滿足堅果及籽類制品中霉菌限量檢測要求。因PCR 檢測不能判斷病原菌的死活狀態，且無法定量，不能直接舉證病原菌的感染力,因而不能作為公共衛生突發事件的病原學診斷依據和食品檢測限量標準的判定依據, 故有待對實時定量PCR 檢測方法作進一步研究。鑒于上述情況，建議在實際工作中和公共安全應急檢驗及對堅果及籽類制品原材料大批量篩選時, 將PCR 法和傳統培養法結合起來使用。根據PCR 最低檢測限可以篩出批量檢品中霉菌含量可能存在不合格的批次,對疑似不合格樣品進行培養確定，從而達到快速精準的檢測目的。

堅果及籽類制品在采摘、晾曬干燥等處理過程及保藏運輸過程中都可能受到霉菌的侵染[16]。散裝、非品牌、流通市場堅果不合格率不容樂觀[17,18]，與本實驗室近年監督抽檢結果一致。一些不法商販為了盈利不惜違法以霉變原料經處理后加工銷售，經處理后的堅果及籽類制品外表無眼觀變化，但果肉可能霉菌量很高或變質。為反映檢測結果的客觀真實性，建議對剝食類帶殼堅果剝去外殼，再取樣檢測。