尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 聯合檢測在糖尿病腎病中的診斷價值分析

劉敏，馬芬

（河南大學第一附屬醫院檢驗科，河南 開封475000）

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發癥,其特征在于腎功能的進行性惡化[1]。同時，早期生物標志物的鑒定將有助于提高疾病的診斷的準確性,闡釋糖尿病腎病的發病機制。目前，尿液中的多種miRNA分子可作為疾病的特異性生物標志物[2]。miRNA 被包裝在外泌體和凋亡小體中，具有高度的穩定性，使其即使脫離細胞內環境亦可抵抗RNase 的降解作用[3,4]。Nassirpour R 等人[5]通過對糖尿病腎病患者的尿液樣本進行高通量miRNA-seq 測序和生物信息學分析,成功鑒定了多個差異表達的且有可能成為標志物的 miRNA, 包括 miR-133b，miR-342 和miR-30a,但該團隊尚未進一步確定上述miRNA 的臨床診斷價值。因此，本研究旨在探討尿液中檢測miR-342，miR-30a 和 miR-133b 對糖尿病腎病的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入 2015 年 10 月至 2018 年 10月我院收治的糖尿病腎病患者30 例，其中男性15例,女性 15 例，平均年齡 52.4±13.3 歲；糖尿病非腎病患者30 例，其中男性13 例，女性17 例，平均年齡53.2±14.2 歲。所有患者均經我院兩名專家確診。拒絕標準：⑴患有精神疾病者；⑵患有或既往患有各類惡性腫瘤者。同時，納入2015 年10 月至2018 年10 月我院接收的健康體檢志愿者，其中男性 15 例，女性 15 例，平均年齡 52.8±10.8 歲。研究開始前獲得醫院倫理委員會批準,入組患者和志愿者均簽署知情同意書。

1.2 Real-time qPCR 采集所有受試人員中段晨尿30 mL。按照制造商說明書規范，使用TRIzol 溶液（Invitrogen）從血液中提取RNA。使用Prime Script RT Master Mix 將 500ng RNA 反向轉錄為 cDNAs。使用 SYBR Select Master Mix 在 ABI 7500 系統上進行qRT-PCR 實驗并分析結果。使用內參基因U6 歸一化，計算函數為 2-ΔΔCT，引物序列見表 1。

表1 引物序列

1.3 統計學分析 R Studio 軟件進行相關分析，三組受試個體的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 指標比較采用 t 檢驗，用表示。應用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的臨床診斷價值。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受試者尿液中 miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表達量比較 觀察組、非腎病組和對照組尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達量均存在顯著差異（P＜0.05），見表 2。

表2 3 組人員尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表達量

2.2 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 分析 為了評估miR-133 b，miR-342 和miR-30a 在觀察組與非腎病組中的診斷價值，繪制 ROC 曲線,見圖 1。miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線下面積分別為 0.90±0.04 （95%CI 0.8266～0.9779）、0.79±0.07 （95%CI 0.6568～0.9143）、0.84±0.06(95%CI 0.7334～0.9577)，以miR-133b 的臨界值1.338, 其診斷靈敏度為80%，特異度為90%；以miR-342 的臨界值2.063，其診斷靈敏度為83%，特異度為83%；以miR-30a 的臨界值2.018, 其診斷靈敏度為87%, 特異度為87%。見圖 1 和表 3。

圖1 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線

2.3 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 分析 為了評估 miR-133b，miR-342 和miR-30a 在觀察組與對照組中的診斷價值，繪制 ROC 曲線,見圖 2。miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 曲線下面積為 0.87±0.05（95%CI 0.7742 to 0.9724）、0.86±0.05 （95%CI 0.7614 to 0.9742）、0.87±0.04 （95%CI 0.7846 to 0.9709）,以miR-133b 的臨界值1.077，其診斷靈敏度為83%，特異度為93%；以miR-342 的臨界值1.110，其診斷靈敏度為87%，特異度為87%；以miR-30a 的臨界值1.093，其診斷靈敏度為83%，特異度為87%。見圖 2 和表4。

圖2 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲線

2.4 檢測尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a對糖尿病腎病的診斷價值 患有糖尿病腎病患者樣本的為真陽性（以病理結果作為參照）,未患有糖尿病腎病的為真陰性(以非腎病組為參照)。以miR-133b 的臨界值 1.338、miR-342 的臨界值 2.063、miR-30a 的臨界值2.018 進行串聯方式的聯合診斷。靈敏度=真陽性個體數/（真陽性個體數+假陰性個體數）×100%，特異度=真陰性個體數/（真陰性個體數+假陽性個體數）×100%， 準確度=（真陽性個體數+真陰性個體數）/總個體數×100%。檢測尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三聯檢測對診斷糖尿病腎病的靈敏度為77%（23/30）, 特異度為93 %（28/30），準確度為 92%（55/60）。

表3 觀察組與非腎病組尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

表4 觀察組與對照組尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

表5 檢測尿液中miR-133b，miR-342和miR-30a 對糖尿病腎病的診斷價值

3 討論

全球約9%的成年人罹患糖尿病[6-8],其中約40%的Ⅰ型糖尿病患者可發生糖尿病腎病，Ⅱ型糖尿病患者中亦有并發糖尿病腎病[9]。存在腎病合并癥的患者面臨腎功能障礙風險的概率更高,如缺血性腎病等[10]。據報道，某些miRNA 與包括腎癌和多囊腎病在內的多種腎臟疾病存在相關性[11-13]。本研究中，我們發現糖尿病腎病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的三者聯合檢測可提高對糖尿病腎病診斷的靈敏度、特異度和準確度。

miRNA 主要發揮轉錄后沉默的作用, 具有高度保守、內源性，片段較短（19～25 個核苷酸）等特點[14]。多項研究旨在表征它們作為生物標志物的潛力[16]。在本研究中，糖尿病腎病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達量均高于糖尿病非腎病患者和健康體檢者（P＜0.05），糖尿病非腎病患者尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達量高于健康體檢者(P＜0.05)。據報道,miR-133b是腎腫瘤的抑制因子[17]，在多囊腎病患者中含量失調[18]。Wang 等人也發現，miR-133b-3p 在老年大鼠骨髓間充質干細胞來源的微泡中下調表達,顯著抑制 HK2 細胞中 TGF-β1 介導的上皮-間質轉化[19]，提示該分子可能在纖維化中發揮作用。miR-342 被證實在I 型和II 型糖尿病中均存在上調表達[20]，在患有活動性腎炎的系統性紅斑狼瘡患者中顯著降低[21]，提示尿miR-342 的表達異常與腎病存在相關性。miR-30 家族的異常表達可致足細胞凋亡，蛋白尿腎病和腎小球硬化等[22]。尿液中miR-30a 的水平與局灶節段性腎小球硬化的活動有關,并且對類固醇治療效果有一定提示意義[23],說明尿液中miR-30a 的表達水平是腎病預后的潛在標記物。糖尿病腎病患者和糖尿病非腎病患者的miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的靈敏度分別為 80%，83%和87%；特異度分別為90%，83%和87%；廣圣芳等人[24]發現 Hcy、Cys-C、SOD 作為診斷糖尿病腎病的生物標志物時靈敏度、 特異度及準確度分別為85.3%、82.7%及84.2%。在本研究中，尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三聯檢測對診斷糖尿病腎病的靈敏度為77%，特異度為93%，準確度為92%。因此,尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a聯合診斷的特異度和靈敏度均高于中性粒細胞與淋巴細胞比值，顯示了其較好的診斷效能。

糖尿病從發展到糖尿病腎病共歷經五個階段，第一階段高血糖狀態下，腎臟逐漸肥大，腎小球呈高濾過狀態，未出現尿蛋白現象[25]。既往糖尿病腎病診斷指標中,尿蛋白從第二階段起才可作為診斷糖尿病腎病的靶標。因此，進一步探討尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表達水平與糖尿病腎病發生發展中的五個階段的關系是下一步的研究方向。盡管miR-133b, miR-342, miR-30a的單向診斷或兩兩聯合診斷的靈敏度均高于三者聯合診斷，但是，其特異度均小于三者聯合診斷。此外,單個分子可作為多種疾病的標志物,比如miR-133b 可作為急性心肌梗死的生物標志物[26], miR-342 可作為急性髓細胞白血病的生物標志物[27]，miR-30a 可作為缺血性卒中的生物標志物[28]。使用單個分子進行診斷時,如果患者患有此分子可診斷的其他疾病，就會造成大量的誤診。因此，尿液中miR-133b，miR-342, miR-30a 三者的聯合診斷能夠更加特異性的針對糖尿病腎病。

綜上所述,尿液中miR-133b,miR-342 和miR-30a 聯合檢測可作為診斷糖尿病腎病的潛在標志物。