不同臨床類型慢性HBV 感染患者的血清HBVRNA 檢測分析

徐振興 ，黃利堅 ，王秀麗 ，滕菁 ，梁偉真

（福建省廈門市中醫(yī)院1.檢驗科；2.肝病中心，福建 廈門 361009）

乙型肝炎病毒(HBV)嚴重威脅人類健康，目前對于HBV 的認識已取得較大進展。近年來的研究初步揭示了血清HBVRNA 的性質，提示其以病毒樣顆粒形式存在與患者血清中，與肝細胞內cccDNA 存在相關性，可能反映抗病毒療效等。但是血清HBVRNA 在慢性HBV 感染不同臨床類型中的分布如何少有報道。本文旨在通過研究CHB 患者血清中HBVRNA 的檢出情況，探討血清HBVRNA的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象 2018 年1 月至2019 年8 月在我院肝病中心診治的住院及門診患者,從中選取477 例資料完整的病例，按病因分為5 組,見表1,其中關于慢性 HBV 攜帶者、HBeAg 陽性 CHB、HBeAg 陰性CHB 和非活動性HBsAg 攜帶者病例的診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2015 更新版)[1]，CHB 治療后HBsAg 陰轉者的納入標準為CHB 治療后連續(xù) 2 次（至少間隔 3 個月）血清 HBsAg＜0.05IU/ml。

1.2 血清指標檢測 空腹抽取患者靜脈血5ml，一小時內分離血清,-20℃保存待測。實時熒光定量PCR 法檢測血清HBVRNA, 檢測系統(tǒng)為安普利GeneLight9800 核酸分析系統(tǒng), 試劑為北京熱景生物技術有限公司乙型肝炎pgRNA 檢測試劑盒。嚴格按照試劑說明書進行操作。HBVRNA 的檢測下限為300copies/ml，其檢測有效性判定：每批次檢測均用試劑盒自帶陰陽性對照作為定性質控，陽性標本擴增曲線符合典型“S”形；定量標準曲線滿足斜率在-3.0 和-3.5 之間以及 r2＞0.98。

表1 477 例病例分組情況

1.3 統(tǒng)計學方法 CHB 患者血清HBVRNA 陽性率與HBeAg、HBVDNA 陽性率的相關性分析及不同分組間HBVRNA 陽性率的比較采用χ2檢驗，HBVRNA 含量與HBVDNA 含量先分別進行Log10轉換，再采用Pearson 相關作相關性分析。以雙側P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同CHB 患者血清 HBVRNA 陽性率 HBVRNA 陽性率從大到小排序為：HBeAg 陽性CHB組 55.5%(66/119)、 慢性 HBV 攜帶者組 42.2%(46/109)、 非活動性 HBsAg 攜帶者組 28.3%(32/113)、HBeAg 陰性 CHB 組 10.4%(11/106)以及 CHB 治療后HBsAg 陰轉者組6.7%(2/30)，總陽性率為32.9%(157/477)；各組間差異有顯著性(χ2=66.48,P=0.000)。

2.2 血清 HBVRNA 陽性率與 HBeAg、HBVDNA 陽性率的相關性,見表2。HBeAg 陽性組的HBVRNA陽性率（49.1%，112/228）顯著高于 HBeAg 陰性組（18.1%,45/249）（P=0.00）；HBVDNA 陽性組的 HBVRNA 陽性率（36.5%，124/340）顯著高于 HBVDNA 陰性組（24.1%，33/137）（P=0.01）

表2 血清HBVRNA 陽性率與HBeAg、HBVDNA 的關系

2.3 血清HBVRNA 含量與HBVDNA 含量的相關性。在所有組別中,對 HBVRNA 與 HBVDNA 同時陽性的的數(shù)據(jù)進行Log10 轉換后分析，結果表明它們之間存在一定的相關性（r=0.264，P=0.008）。見圖1。

圖1 血清HBVRNA 含量與HBVDNA 含量的關系

3 討論

血清HBVRNA 成分已被證實為3.5kb 的病毒前基因組 RNA（pregenomeRNA，pgRNA），來源于未完全轉錄而遺留的pgRNA,也可能為核衣殼包裹的pgRNA 在未啟動逆轉錄步驟的情況下直接獲得包膜并從感染的肝細胞中釋放出來,以病毒樣顆粒形式存在[2，3]。基于核苷類似物（NAs）不能抑制 cccDNA 轉錄生成mRNA,理論上可以推斷pgRNA 與cccDNA 水平相關,血清中HBVRNA 可以反映肝細胞內cccDNA 水平，因此已有較多的研究者認為血清HBVRNA 可作為潛在的NAs 治療的新標記物，用以指導患者核苷和核苷酸類藥物安全停藥的指標等[4,5,6]。

我們對不同臨床類型CHB 患者血清HBVRNA 的陽性率進行了調查, 發(fā)現(xiàn)HBeAg 陽性CHB組＞慢性HBV 攜帶者組＞非活動性HBsAg 攜帶者組＞HBeAg 陰性 CHB 組＞CHB 治療后 HBsAg 陰轉者組，各組間差異有顯著性（χ2=66.48，P=0.000）。這一結果表明血清HBVRNA 與患者的免疫狀態(tài)、HBV 的復制情況以及肝細胞內cccDNA 的轉錄活性有關,也提示在評估NAs 停藥后復發(fā)風險方面值得深入研究[7,8]。

有研究結果表明HBeAg 狀態(tài)可影響血清HBVpgRNA 與 cccDNA 的相關性，HBeAg 陽性患者的血清HBVRNA 水平與肝內cccDNA 呈顯著相關，但HBeAg 陰性患者的血清HBVRNA 水平與肝內 cccDNA 無相關性[9]。本文 HBeAg 陽性組的 HB VRNA 陽性率(49.1%，112/228)顯著高于 HBeAg 陰性組（18.1%，45/249）（P=0.00），提示血清 HBVRNA與HBV 的復制程度相關，同時進一步表明HBeAg陰性患者仍有可能存在病毒復制,具有較強的傳染性。

本研究中，HBVDNA 陽性組的HBVRNA 陽性率 （36.5%，124/340） 顯著高于 HBVDNA 陰性組（24.1%，33/137）（P=0.01），這一結果表明血清 HBVRNA 與HBVDNA 的聯(lián)合應用能較好的反映慢性肝炎患者的HBV 感染狀態(tài)。對于HBVDNA 陰性的血清而言，其檢出的HBVRNA 可能是未參與轉錄而直接釋放入血清的包被顆粒,也可能是抗病毒藥物抑制了逆轉錄過程而后使得HBVRNA 釋放入血。這需要對此類患者作較長時間隨訪檢測來證實，但這也間接提示血清 HBVDNA 小于檢測下限可能僅代表了病毒的逆轉錄過程被抑制,并不能反映 cccDNA 的轉錄狀態(tài)，有轉錄活性的cccDNA仍會以 HBVRNA 病毒樣顆粒的方式產(chǎn)生子代病毒。因此HBVRNA 可能作為較好的監(jiān)測持續(xù)的病毒學應答及肝細胞核內 cccDNA 池的耗竭的潛在指標[10]。

本研究對HBVRNA 和HBVDNA 的血清濃度值進行Log10 轉換后作相關分析，結果發(fā)現(xiàn)盡管它們之間存在一定的相關性(P=0.008),但相關程度較低(r=0.264)。這可能進一步提示血清HBVRNA 既可能來源于轉錄所剩的核酸顆粒 (與HBVDNA 一起反應HBV 的復制狀態(tài))，也可能是來源于阻斷逆轉錄后的核酸顆粒(反應抗病毒的效果或停藥的指標)。

綜上所述,血清HBVRNA 可能與肝細胞內ccc DNA 轉錄活性有關,在抗病毒療效的考核以及CH B 患者的臨床管理方面有著一定的意義。本研究的局限性在于沒有調查血清HBVRNA 與肝功能受損情況以及與HBcrAg、隱匿性乙肝的關系。