2018 年江西省生活污水中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測分析

肖芳 ，陸輝 ，劉曉慶 ，劉師文 ，李健雄 ，熊英

（1.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029；2.江西省衛(wèi)生健康委疾控處，江西 南昌 330006）

脊髓灰質(zhì)炎又名小兒麻痹癥,是由脊灰病毒引起的一種急性傳染病[1]。口服脊灰減毒活疫苗( O-ral poliovirus attenuated live vaccine，OPV) 是我國消滅脊灰的重要策略之一，但由于OPV 在人體內(nèi)復(fù)制增殖過程中可發(fā)生基因變異和毒力回復(fù),從而引發(fā)疫苗相關(guān)麻痹型脊灰(Vaccine associated paralytic poliomyelitis，VAPP) 病 例[2,3]和 疫 苗 衍 生 脊 灰病毒( Vaccine -derived polio virus，VDPV) 病例[4,5]。我國所屬的西太區(qū)2000 年宣布進入無脊灰狀態(tài)。截至目前，仍有3 個國家（巴基斯坦、阿富汗、尼日利亞）一直有本土脊灰野病毒（Wild PV，WPV）的流行，其中有兩個國家與我國接壤。2011 年，我國新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)生源自巴基斯坦的輸入1 型WPV 疫情[6]，我國維持無脊灰狀態(tài)形勢非常嚴峻。脊髓灰質(zhì)炎病毒主要通過糞-口途徑傳播，病毒可在外環(huán)境條件中存活,并在人、病毒和環(huán)境間循環(huán)，在生活污水監(jiān)測脊灰病毒更能直接反映環(huán)境中脊灰病毒的存在及循環(huán)狀況,為脊灰的防控工作提供更多依據(jù)[7]。

1 材料與方法

1.1 采樣點的確定 青山湖區(qū)污水處理廠為南昌市日處理污水量最大的污水處理廠,每日處理污水50 萬噸，選擇該廠入水口作為每月固定采樣點。每月月初采集500 毫升/瓶，兩瓶水樣，冷藏運輸至江西省疾病預(yù)防控制中心疾病控制檢驗所脊灰實驗室。

1.2 污水處理

1.2.1 前處理 對采集的1 升水樣用陰離子膜吸附水中病毒濃縮技術(shù)進行處理。首先3000rpm，4℃離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至燒杯中。然后加入2.5M 的MgCl2（終濃度 0.05M），用 0.5N 的 HCl 調(diào)節(jié) pH 值為 3.5～4.0 之間。

1.2.2 過濾 在生物安全柜中將經(jīng)過前處理的污水倒入已高壓的裝有0.45μm 混合硝酸纖維濾膜（ADVANTEC，045A142C,10040014）的過濾器中,為防止抽濾過程中濾膜被堵住, 在0.45μm 的濾膜上方又放置了一張 10μm 的濾膜（ADVANTEC，Y100 A124A,15210012）。過濾器與正壓泵相連,過濾時盡量慢點,5～10min 濾完。在生物安全柜中拆開過濾裝置,將兩張濾膜用無菌的鑷子取出放置于無菌培養(yǎng)皿中。用無菌的剪刀及鑷子將濾膜剪碎,放入50 mL 無菌離心管中[8]。

1.2.3 振蕩及離心 在50ml 無菌離心管加入10 mL 3%的無菌牛肉浸出液,1g 無菌玻璃珠于振蕩器上振蕩20min， 將上清液吸出于15ml 無菌離心管中（第一次洗脫液）,再向50ml 無菌離心管加入10 ml 3%的無菌牛肉浸出液，繼續(xù)振蕩20min，將上清液吸出于另一15ml 無菌離心管中 （第二次洗脫液）。將兩次洗脫液于4℃ 3000rpm 離心15min。

1.2.4 無菌過濾及接種 用0.45μm 針式過濾器將兩次離心后的上清分別過濾于5ml 的無菌凍存管中。取 200μl 抽提液接種至 24 孔板細胞上（RD、L20B、Hep-2），第一次洗提液加 5 孔，第二次洗提液加3 孔。

1.2.5 病毒的分離與鑒定 按 《脊灰實驗室操作手冊》（WHO 第四版）[9]及補充資料的規(guī)程對生活污水中脊灰病毒進行分離培養(yǎng)，對L20B 陽性分離物進行脊灰病毒型內(nèi)鑒定。

1.2.6 VP1 區(qū)序列測定 用 TAKARA PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2(AJ21030A) 試劑盒對獲得的23 株P(guān)V 株VP1 區(qū)進行擴增, 引物序列為：UG1：5′-TTTGTGTCAGCGTGAATGA-3′；UC11：5′- AAGAGGTCTCTATTCCACAT-3′[10]。擴增片段大小約 1.1kb, 反應(yīng)條件為：50℃ 30min,95℃ 2min；94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 1min,35 個循環(huán)；72℃ 10min[11,12]。獲得的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.2.7 序列整理及分子生物學(xué)信息分析 已測序的序列用DNAStar5.0 的 Seqman 進行序列的拼接，采用Mega 5.0 軟件進行核苷酸和氨基酸同源性分析、 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及遺傳距離的分析。PV Sabin 1～3 疫苗株參考序列號為 AY184219～AY1 84221。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 2018 年1 月-12 月采集了 12 份水樣，除7 月及11 月份未分離出脊灰病毒其余月份均分離出了脊灰病毒,共分離脊灰病毒23 株，分離率為83.33%，見表1。

2.2 病毒的鑒定 分離的23 株脊灰毒株經(jīng)ITD 及VDPV 鑒定均為疫苗相似株,其中PV 1 型2 株(8.7%),PV 2 型 0 株,PV 3 型 21 株(91.3%)。見表 2。

2.3 VP1 區(qū)序列分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 經(jīng)測序及序列拼接，23 株P(guān)V 株均獲得1100bp 左右的核苷酸序列。其中 PV1 與 Sabin 1（AY184219）的同源性為 99.7～100%,PV3 與 Sabin 3 （AY184221）的同源性為99.0～100%。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如下圖。

表1 2018 年每月分離脊灰病毒情況

表2 每月分離脊灰病毒鑒定情況

圖1 系統(tǒng)進化發(fā)生樹

2.4 突變位點分析 對分離的23 株P(guān)V 株VP1 區(qū)進行核苷酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，12 株脊灰病毒毒株在VP1 區(qū)發(fā)生了核苷酸變異，其中PV 1 型的核苷酸變異數(shù)在≤3 個，PV 3 的核苷酸變異數(shù)在≤5個。基因序列已上傳至 NCBI，Genebank 為：MT3 60741～MT360743 及 MT349683～MT349703。見表3。

3 討論

AFP 病例監(jiān)測仍是目前全球消滅脊灰計劃中的金標準，而環(huán)境監(jiān)測可以提供一些補充信息。由于PV 是糞口途徑傳播,因此從生活污水中檢測PV可以用來評估PV 在環(huán)境中的循環(huán)，估計環(huán)境人口中感染者的數(shù)量，因而可以將PV 環(huán)境監(jiān)測結(jié)果作為某一特定人口地區(qū)無脊灰循環(huán)的指標,為中國維持無脊灰狀態(tài)提供環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)。2015 年WHO證實2 型脊灰病毒導(dǎo)致的脊灰已被消滅，2016 年5 月1 日前全球已停止使用tOPV,我們國家脊髓灰質(zhì)炎疫苗的接種程序調(diào)整為1 劑次的IPV 和2 劑次的bOPV,疫苗中不再含有2 型脊灰減毒成分。脊灰疫苗接種策略調(diào)整后,一旦環(huán)境中存在2 型脊灰病毒,沒有產(chǎn)生2 型脊灰抗體的人很有可能被感染并有傳播引發(fā)病例的風(fēng)險。2018 年新疆在環(huán)境污水中分離出了2 型脊灰疫苗衍生株[13]，我們省環(huán)境中是否仍有脊灰2 型病毒的循環(huán)，2 型病毒是否發(fā)生變異，是我們需要解決的問題。

表3 毒株突變位點。

本研究2018 年對青山湖區(qū)污水處理廠入水口污水樣本開展脊灰病毒監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)所監(jiān)測污水中未分離出2 型脊灰病毒,分離出的1 型和3 型脊灰病毒均為疫苗相似株, 未監(jiān)測到WPV 株和VDPV株。PV3 型的構(gòu)成比為 91.3%，可見PV3 型為江西省生活污水中的PV 優(yōu)勢株, 這與我們過去AFP病例監(jiān)測的結(jié)果是一致的[14]。

PV1 型對毒力有明顯影響的突變熱點是nt2747 和 nt2795[15]。2018 年在污水中分離到的 2株P(guān)V1 型疫苗株在這兩個位點均無突變。有1 株（JX2018JHH024R）在 nt2749 處發(fā)生(A-＞G) 的突變,導(dǎo)致甲硫氨酸(Met)替代了異亮氨酸(Ile)；在nt28 31 處發(fā)生了(T-＞C)及 nt3346 處發(fā)生了(T-＞C)堿基的變異，但其所編碼的氨基酸未發(fā)生改變。PV3 型疫苗株主要突變熱點位于第2636nt 處。有兩株(JX2018JHH095L、JX2018JHH097L)在 nt2636 處發(fā)生了(G-＞A)的變異，導(dǎo)致了極性氨基酸替代了疏水氨基酸，需繼續(xù)持續(xù)監(jiān)測毒株變異情況。

當前全球流行的脊灰野病毒只有Ⅰ型,并且流行國家都是中國的鄰國,野病毒輸入的風(fēng)險一直存在[16]。bOPV 的使用有VDPV 的出現(xiàn)和循環(huán)的風(fēng)險。要最終消滅 VDPV，就需全面停用OPV，改為全程接種 IPV，才有可能最終消滅脊灰[17]。在無脊灰證實階段，保持 AFP 病例監(jiān)測的敏感性，并將外環(huán)境監(jiān)測作為AFP 病例監(jiān)測的有力補充,加強對PV 的監(jiān)測，控制可能出現(xiàn)的VDPV 傳播，對全球消滅脊灰行動最終目標的盡快實現(xiàn)具有重要意義。