秸稈酶解液脫毒工藝對異養小球藻發酵的影響

楊磊，辛納慧，李鈺媛，劉雨，畢生雷，張乃群*

1. 南陽師范學院生命科學與技術學院（南陽 473061）；2. 河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室（南陽 473000）

微藻食品是既新穎又傳統的食品。與其他傳統藻類食品相比，微藻食品含有多肽、藻蛋白、不飽和脂肪酸和藻多糖，能夠對糖尿病患者、心臟病患者、高血壓患者、低免疫力人群起到良好的保健作用。微藻食品中含有的嘌呤還具有抑制膽固醇形成、促進膽固醇分解排泄、降低血脂的功效。同時，食用微藻食品還富含膳食纖維，能夠增加飽腹感，有助于幫助肥胖人群減肥。因此，繼螺旋藻之后，小球藻、雨生紅球藻也越來越多地被用于保健品，微藻食品也越來越多地受到關注。異養小球藻與其他自養藻類相比，具有不占用耕地、不受氣候因素影響、可利用工業化生產裝置、生長周期短、含油量高等優點，但由于異養小球藻培養成本高，相關產品一直未能推出市場[1]。使用秸稈能夠大幅降低異養小球藻原料成本，從而為產業化奠定基礎。

秸稈是指農作物成熟脫粒后剩余的莖葉部分，通過農作物的光合作用，農作物中有一半的產物遺留在秸稈中[2]。在生活中秸稈是天然的綠色飼料，有機質含量約15%，碳水化合物含量約30%，1 t秸稈的營養價值相當于0.25 t糧食[3]，因此近年來秸稈越來越多地被用于替代糧食成為生物發酵的原料。秸稈的有效利用能夠解決長期以來生物發酵與民爭糧的問題和秸稈未充分利用帶來的環境污染問題。秸稈的化學組成主要包含有半纖維素、木質素，約占固體物料總質量的80%，還有少量果膠、淀粉和單寧。秸稈天然的抗解結構阻礙纖維素降解為可發酵的糖類[3]，蒸汽爆破是應用較多的秸稈預處理方法，但隨之產生的香草醛、阿魏酸、愈創木酚等物質能夠抑制大部分微生物的正常生長，脫毒工藝成為消除抑制物的關鍵[4]。

常用的脫毒方法包括活性炭吸附、中和法、膜蒸餾法、酶處理法等，這些新興脫毒方法在降低抑制物含量的同時還存在著試劑殘留、成本高、糖損失多等各種問題，不利于規模化應用，尋找成本低、易操作的脫毒工藝有助于推動秸稈作為生物質能源原料的應用進程。蒸汽爆破產生的酸類、酚類、醛類抑制物均溶于水，且沸點普遍低于300 ℃，水洗法能夠使抑制物溶于水并隨著濾液脫離秸稈爆破料，高溫烘干法則能夠使抑制物汽化、脫離秸稈爆破料，水洗+濾液回收則是在水洗法基礎上優化以提高糖利用率的工藝，這幾種工藝都有工藝簡單、設備投資小的特點。擬在3種工藝的基礎上研究秸稈酶解液脫毒工藝對異養小球藻發酵結果的影響，以降低異養小球藻的培養成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

異養小球藻（清華大學生命科學院）；玉米秸稈、黑曲霉、纖維素酶（河南天冠企業集團有限公司）；沸石粉、葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉等（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗設備

蒸汽爆破裝置、洗滌裝置（自制）；LNB2.5-10F型馬弗爐（上海皓莊儀器有限公司）；FE20-FiveEasy Plus型pH計（梅特勒-托利多集團有限公司）；202-2型電熱恒溫干燥箱（上海博珍儀器設備）；L400型離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；YXQ-WF型滅菌鍋（上海印溪儀器儀表有限公司）；ZWY-111B型搖床（上海智誠儀器設備有限公司）；DK-600型恒溫水浴鍋（上海精密科學儀器有限公司）；SC-237型展示柜（青島澳柯瑪股份有限公司）；安捷倫2100型液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 秸稈爆破預處理方法

使用蒸汽爆破預處理，將玉米秸稈烘干至恒質量，過60目篩，室溫密封儲存。準確稱取50 g 樣品，將5 g水霧化均勻噴灑在試樣上。裝入塑料袋密封，室溫條件下浸潤12 h。將試樣進行蒸汽爆破（汽爆條件為蒸汽壓強2.2 MPa、壓力維持時間200 s）預處理，汽爆后收集物料備用[5]。

1.3.2 脫毒方法

1.3.2.1 水洗脫毒法

將一定量的汽爆玉米秸稈，按m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5比例混勻攪拌，浸泡60 min后過濾，濾渣80 ℃烘干至恒重，作為酶解的原料[6]。

1.3.2.2 水洗+濾液回收脫毒法

將一定量的汽爆玉米秸稈，按m（秸稈）∶m（水）=1∶1比例攪拌混勻，以3 000 r/min離心后，將非溶性固體與60 ℃的相同體積的水混合均勻，反復5次（每次減少洗水體積20%）直至過濾后洗水液呈無色，合并洗水液，并將其放入真空干燥箱中于真空度0.03 MPa下65 ℃濃縮，直至洗水液體積減少50%～70%。向濃縮液中加入沸石粉20%，靜置6 h后取出，以3 000 r/min離心，汲取上清液與爆破物的非溶性固體混合，以此作為酶解的原料[7]。

1.3.2.3 高溫烘干脫毒法

將汽爆玉米秸稈于125 ℃烘至恒質量，以此作為酶解的原料[8]。

1.3.3 洗滌方法[9]

單次洗滌：取適量脫毒后原料，按一定固液比與蒸餾水充分混勻，用氨水調節pH為4.8，濾去游離水以此作為酶解原料。

多次洗滌：取適量脫毒后原料，按一定固液比取蒸餾水，將蒸餾水分3份，每次用一份蒸餾水與原料這個好混勻、濾去游離水，第3次洗滌時用氨水調節pH為4.8。

1.3.4 酶解方法

在三角瓶中加入10 g酶解原料配成50 g/L溶液，加入600 IU纖維素酶液與檸檬酸緩沖液，放入50 ℃恒溫水浴搖床中，在pH 4.8、150 r/min條件下酶解60 h。反應結束后沸水中煮沸10 min離心，上清液經稀釋后測定還原糖濃度[10]。

1.3.5 發酵條件

發酵溫度28 ℃，pH 6.5，轉速200 r/min；發酵培養基配方為：葡萄糖30 g/L、酵母粉3 g/L，K2HPO4·3H2O 0.075 g/L、MgSO4·7H2O 0.075 g/L、CaCl2·2H2O 0.025 g/L、KH2PO40.175 g/L，其他微量營養鹽若干[11]。使用汽爆料酶解液提供50%配料用水，其余部分由自來水補足，葡萄糖含量不足部分由葡萄糖試劑補足。

1.3.6 檢測方法

采用HPLC法測定葡萄糖、木糖含量；細胞數采用血球板計數；干物質質量濃度測定方法：取10 mL發酵液，離心后除去上清液，加蒸餾水至10 mL，再次離心，100 ℃下烘干藻泥，然后計算干質量。

1.3.7 數據分析方法

干物質質量濃度計算如式（1）[11]。

使用Origin 75進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 脫毒工藝優化

汽爆預處理后的原料中會產生乙酸、糠醛等毒性物質。在酶解發酵前應對汽爆處理后的物料進行脫毒處理，但脫毒的過程會導致酶解料成分變化、糖分損耗及設備投資增加及工藝的復雜性。因此，在酶解發酵前脫毒工藝的選擇至關重要[12]。

2.1.1 不同脫毒方法對發酵液干物質質量濃度的影響

發酵液干物質質量濃度是發酵液及發酵液中細胞失去自由水以后的質量濃度，能夠表示發酵液的生物量高低，代表發酵水平好壞。發酵液干物質質量濃度不僅能表明細胞數量、代謝產物的水平，還能表明細胞個體重量，從而更全面的表示發酵水平好壞。同樣條件下發酵液干物質質量濃度越大則發酵液中細胞數量越多、單個細胞質量越大。

不同脫毒方法對發酵液干物質質量濃度的影響如圖1所示，隨著發酵時間的推移，各試驗組的干物質質量濃度均不斷增加，未添加汽爆料酶解液的對照組，發酵速度較快，干物質質量濃度增長迅速，在發酵第5天即達到最大干物質質量濃度（9.76 g/L）。未處理組發酵速度最慢，且在發酵第4天干物質質量濃度達到最大值（2.33 g/L），隨后不斷回落，可能是汽爆料酶解液中的糠醛、乙酸等有害物質含量過高抑制了異養小球藻的正常生長，且發酵后期藻細胞死亡、自溶，導致干物質質量濃度減少。其他3個試驗組在發酵過程中干物質質量濃度也正常增長，但增長速度略低于對照組，水洗+濾液回收組發酵終了干物質質量濃度達到9.29 g/L，接近對照組，而水洗組和高溫烘干組的發酵終了干物質質量濃度分別為8.71和7.25 g/L，說明水洗+濾液回收組脫毒處理最理想，高溫烘干組則殘留較多的有害物質。從發酵液干物質質量濃度評判，水洗+濾液回收組最佳，其次是水洗組，高溫烘干組最差。

圖1 不同脫毒方法對干物質質量濃度的影響

秸稈蒸汽爆破在破壞秸稈內部結構的同時，也導致秸稈中的木質素等物質在高溫條件下產生了酸類、醛類、酚類等眾多對微生物發酵有抑制作用的物質，因此沒有進行脫毒的未處理組異養小球藻生長受到嚴重抑制。酸類、醛類等抑制物的沸點均介于60～138℃之間，能夠在高溫烘干條件下去除，但酚類抑制物的沸點普遍高于200 ℃難以被去除，因此高溫烘干組雖然能夠生長但生長情況低于其他處理組。酸類、酚類、醛類等抑制物均溶于水，水洗能夠有效降低抑制物含量，從而有利于發酵的正常進行，因此水洗處理的發酵干物質質量濃度高于高溫烘干組。水洗的同時會導致部分糖損失，而水洗+濾液回收則能夠將損失在水洗液中的糖再利用起來的同時進一步降低酸類、醛類、酚類物質的抑制作用，從而使發酵結果更佳[3]。

2.1.2 不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響

葡萄糖是異養小球藻能夠直接利用的碳源，且利用效率最高。葡萄糖含量的變化能夠反映異養小球藻生長和代謝情況。

不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響如圖2所示，隨著發酵時間推移，葡萄糖含量不斷降低，特別是對照組，葡萄糖含量降速最快，在發酵第5天，葡萄糖含量即降到0，說明對照組提供的發酵液環境最適合異養小球藻發酵，異養小球藻的生長、代謝均比較旺盛。水洗+濾液回收組次之，在發酵第6天，葡萄糖含量降到0。水洗組、高溫烘干組則在發酵第5天后葡萄糖含量較低時消耗速度迅速放緩。而未處理組的葡萄糖含量一直處于緩慢下降過程中，在發酵進行到第4天以后，葡萄糖含量不再變化。

發酵初期除了未處理組外，其他試驗組葡萄糖含量比較接近，說明未處理組中成分更為復雜，培養基在高溫滅菌時受到美拉德反應更為明顯。對照組沒有受到任何抑制作用，因此在發酵第5天葡萄糖即消耗完畢，未脫毒處理組葡萄糖消耗非常緩慢，說明未處理組提供的發酵液環境中殘留的抑制物質過多，影響異養小球藻的正常生長和代謝，在發酵后期由于異養小球藻細胞酶活性衰竭、生長代謝停滯，導致葡萄糖不再消耗，葡萄糖含量不再變化。所有脫毒處理組與對照組相比，葡萄糖消耗均有一定的延后，說明使用脫毒處理并沒有完全消除抑制物的影響，不同的脫毒工藝酸類、酚類、醛類等抑制物質殘留程度不同導致葡萄糖消耗速度不同，在發酵結束時高溫烘干組在所有脫毒處理組中葡萄糖殘留最多，其次是水洗組，水洗+濾液回收組葡萄糖消耗完畢，試驗結果與發酵干物質質量濃度結果互相印證，說明水洗+濾液回收組更有利于發酵進行[13]。

圖2 不同脫毒方法對葡萄糖含量的影響

2.1.3 不同脫毒方法對pH的影響

pH反映發酵液中微生物細胞的生長環境，以及微生物細胞的代謝水平。異養小球藻發酵過程產酸，正常發酵過程pH不斷降低，而到發酵末期，由于細胞營養物質跟不上，藻細胞衰老、自溶，從而導致pH上升。另外，發酵過程中如果溶氧過低、滲透壓過大等影響藻細胞正常生長、代謝的因素均會導致藻細胞死亡、pH上升。

不同脫毒方法對發酵液pH的影響如圖3所示，隨著發酵時間的推移，未處理組的pH不斷上升，說明未處理組的發酵液環境不適宜異養小球藻生長，在發酵過程中不斷有藻細胞死亡從而導致pH不斷上升，而其他試驗組的pH開始不斷下降，說明藻細胞在代謝過程中不斷產酸，藻細胞生長代謝正常，而在發酵末期，由于細胞老化，藻細胞死亡數量過多，導致pH上升。在發酵初期，對照組的pH最高，未處理組的pH最低，這可能是汽爆料中乙酸等物質影響了發酵液的pH。

結合圖1～圖3，水洗+濾液回收組的發酵過程和結果最接近對照組，其次是水洗組，未處理組則不能提供適合異養小球藻生長、代謝的環境。但水洗+濾液回收組處理濾液需要使用沸石粉，沸石粉雖然能夠吸附糠醛等醛類抑制物，但不能有效吸附乙酸等有機酸類抑制物，而且在使用過程中又有部分吸附的抑制物返回到汽爆料漿中，而從發酵液干物質質量濃度來看，水洗+濾液回收組僅比比水洗組高0.58 g/L，增加幅度不大，卻需要消耗新的原料，因此，選擇使用水洗處理汽爆料。

圖3 不同脫毒方法對pH的影響

2.2 洗滌工藝優化

水洗能夠降低酸類、酚類、醛類等發酵抑制物，但同時水洗還需要消耗大量的水資源，水洗之后產生的廢液也會造成明顯的環保壓力和成本壓力，因此優化洗滌工藝有助于提高產量、減少成本。在相同用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）條件下，開展單次洗滌和多次洗滌對異養小球藻發酵結果影響的研究，結果見圖4。

圖4和圖5分別是不同洗滌方法和不同用水量對干物質質量濃度的影響。隨著用水量增加，發酵終了干物質質量濃度也不斷增加，用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶7.5試驗組比1∶5試驗組提高5.44%，而用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶9試驗組比1∶7.5試驗組提高2.36%，干物質質量濃度增加比率下降明顯。用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶7.5）1∶9試驗組發酵終了干物質質量濃度達到9.53 g/L接近于對照組的9.76 g/L，說明多次洗滌、用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶9）能夠滿足需要。

圖4是不同洗滌方法對干物質質量濃度的影響，單次洗滌試驗組和多次洗滌試驗組發酵終了干物質質量濃度分別為8.7和9.31 g/L，多次洗滌試驗組比單次洗滌提高6.89%。多次洗滌可提高水資源利用效率。

圖4 不同洗滌方法對干物質質量濃度的影響

圖5 不同用水量對干物質質量濃度的影響

3 小結

使用不同脫毒方法處理汽爆料，結果發現使用水洗脫毒法處理汽爆料發酵終了干物質質量濃度比對照組低10.76%，使用水洗脫毒法處理汽爆料對異養小球藻正常生長、代謝沒有太大影響，進一步優化洗滌工藝，結果發現，使用多次洗滌、用水量（m（秸稈）∶m（水）=1∶9），發酵終了干物質質量濃度達到9.53 g/L，僅比對照組低2.41%，能夠滿足需要。水洗脫毒法處理汽爆料工藝簡單、操作步驟少，適宜于規模化生產使用。