響應面法優化螺旋藻蛋白部分酶解工藝

陳小杏，劉慧，張少斌*，趙嶝科，辛橋，劉金洲

1. 沈陽農業大學生物科學技術學院（沈陽 110866）；2. 沈陽農業大學土地與環境學院（沈陽 110866）

螺旋藻是一種低等原核生物，屬于藍藻門，藍藻綱，段殖體目，顫藻科，螺旋藻屬[1-2]。螺旋藻營養成分豐富而均衡，含有多種生物活性物質，如藻膽蛋白、螺旋藻多糖、不飽和脂肪酸、β-胡蘿卜素、維生素E、各種微量元素等，具有抗氧化、降血壓、降血脂、提高機體免疫力、防癌抑癌、延緩衰老等多種生理功能[3-4]。

相比于動物蛋白，植物蛋白不僅來源廣泛、成本低廉，而且植物性蛋白食品幾乎不含膽固醇，飽和脂肪酸少，對人體健康更有利。然而，植物蛋白相對分子質量較大，同時受到纖維素的影響，不易消化吸收[5]。因此，利用物理、化學以及酶學方法，體外將植物蛋白部分降解為生物肽和氨基酸，不僅可以提高蛋白質的吸收利用率，而且可以去除某些蛋白的免疫原性[6-9]。從螺旋藻中提取螺旋藻蛋白，并將其部分水解制備螺旋藻肽，不僅提高螺旋藻蛋白質吸收利用率，去除螺旋藻藻腥味，提高食品適口性，而且還可以從中分離制備具有特殊生理功能的生物活性肽[10-13]。

目前，酶解螺旋藻使用的原材料基本都是螺旋藻干粉[14-17]，螺旋藻在干燥過程中，部分蛋白質會變性降解。因此，此次試驗采用鮮活螺旋藻分離蛋白質，選用5種蛋白酶對螺旋藻蛋白進行水解，確定最優水解條件，為螺旋藻蛋白的綜合開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻（鈍頂螺旋藻直線突變株，SP-Dz，實驗室自養）；各種蛋白酶（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。

HH-4恒溫水浴鍋（常州國華有限公司）；FA2104A電子分析天平（上海新諾儀器設備有限公司）；TGL-16高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發公司）；722型分光光度計（山東高密彩虹分析儀器有限公司）；pH-25酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；FD-1冷凍干燥機（北京德天佑科技發展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 螺旋藻蛋白的酶解

采用凍融法裂解新鮮螺旋藻[8]，在10 000g下離心15 min，棄去沉淀，得到螺旋藻蛋白提取液。將適量螺旋藻蛋白溶液加入試管，放入水浴鍋中，調節水浴鍋的溫度使其達到適宜的酶解溫度，用NaOH或HCl調節到適當的pH，并按照比例加入蛋白酶，進行酶解。在達到酶解時間時，將螺旋藻蛋白酶解溶液放入95 ℃水浴鍋中迅速滅酶10 min，冷卻后，在10 000g下離心30 min，棄去沉淀，測定上清液的水解度。

1.2.2 水解度的測定方法

參照孫媛媛等[18]的方法。采用凱氏定氮法測定酶解液中的總氮含量，采用甲醛滴定法測定α-氨基氮含量，然后按式（1）計算水解度。

水解度=上清液中α-氨基氮含量/上清液總氮含量×100% （1）

1.2.3 單因素試驗方法

1.2.3.1 酶加入量的確定方法

取6個10 mL試管，分別加入1 mL螺旋藻蛋白質提取液，分別加入濃度1%～6%的蛋白酶，酶解3 h，測定酶解產物的水解度。

1.2.3.2 酶解溫度的確定方法

分別于6個10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質提取液，依次加入3%的蛋白酶，酶解溫度設定范圍為35～75 ℃，酶解3 h，測定酶解產物的水解度。

1.2.3.3 酶解時間的確定方法

分別向6個10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質提取液，依次加入3%的蛋白酶，分別酶解1～6 h，測定酶解產物的水解度。

1.2.3.4 pH的確定方法

依次向6個10 mL試管中加入1 mL螺旋藻蛋白質提取液，加入3%的蛋白酶，pH設定范圍為5.5～11.0，酶解3 h，測定酶解產物的水解度。

1.2.4 響應面法優化木瓜蛋白酶酶解螺旋藻蛋白工藝

通過Design Expert 7.0軟件中Box-Behnken Design（簡稱BBD）的設計方法[19]，選定酶加入量、酶解溫度和酶解時間3個因素，設計3個試驗水平，以水解度為響應值，通過響應面分析，進行水解條件的優化。響應面分析因素水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶加入量對螺旋藻蛋白水解的影響

酶加入量是影響酶解效果的基本因素。如圖1所示，酶加入量在1%～5%范圍內，水解度隨著酶加入量的增加而線性增加。但酶加入量增加，不僅可能導致蛋白質水解過度，氨基酸含量增加，生物活性肽含量下降，而且還會導致生產成本增加。在5種蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高，風味蛋白酶水解度最低。

圖1 酶加入量對水解度的影響

2.1.2 酶解溫度對螺旋藻蛋白水解的影響

如圖2所示，不同蛋白酶最適作用溫度不同，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶最適溫度為55 ℃，胰蛋白酶最適溫度為50 ℃，中性蛋白酶最適溫度為45 ℃，風味蛋白酶最適溫度為40 ℃。在酶的最適作用溫度條件下，螺旋藻蛋白水解度最大，在5種蛋白酶中，木瓜蛋白酶水解度最高。低于最適溫度，水解度隨溫度增加而增加，高于最適溫度，由于酶蛋白變性，水解度隨溫度增加而下降，這與大多數酶的理化特性相同[20]。

圖2 酶解溫度對水解度的影響

2.1.3 酶解時間對螺旋藻蛋白水解的影響

如圖3所示，在3 h內，5種蛋白酶對螺旋藻蛋白的水解度均呈線性增加；4 h后，水解度增加緩慢，直至停止。其中，木瓜蛋白酶的水解度遠高于堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶。

圖3 酶解時間對水解度的影響

2.1.4 pH對螺旋藻蛋白水解的影響

如圖4所示，不同蛋白酶的最適作用pH不同。木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的最適pH為6.5，中性蛋白酶的最適pH為7.0，胰蛋白酶的最適pH為8.0，堿性蛋白酶的最適pH為10.0。低于最適pH，水解度隨pH增加而增加，高于最適pH，水解度隨pH增加而下降，這是由于pH會影響酶和底物可解離基團的帶電情況，從而影響酶與底物的相互作用，這與大多數酶的理化特性相同[20]。

圖4 pH對水解度的影響

從前述單因素試驗可以看出，在相同條件下，木瓜蛋白酶水解度最大，風味蛋白酶水解度最小，其他酶的水解度居中。因此，選擇木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，并用響應面法優化酶解工藝。

2.2 響應面試驗設計與結果

由單因素試驗結果可知，木瓜蛋白酶對螺旋藻蛋白溶液酶解3 h后，其水解度增加緩慢，因此固定酶解時間3 h，選擇pH、酶加入量和酶解溫度3個因素進行響應面優化。在三因素三水平上設計17組試驗，并按照設計方案分別進行試驗，得出各自的水解度，即響應值，如表2所示。

表2 響應面設計方案與試驗結果

2.2.1 回歸方程

將試驗中各響應值輸入軟件，通過Design Expert 7.0軟件中ANOVA對試驗進行方差分析，結果如表3所示。軟件對各個因素水平進行擬合，得到二次響應面回歸方程：

2.2.2 方差分析

從表3可以看出，一次項A（pH）和B（酶加入量）對解離度的線性效應極顯著，C（溫度）對解離度的線性效應顯著。由F值大小可以看出，最適pH對螺旋藻蛋白溶液的水解度影響最大，其次是酶加入量，酶解溫度的影響最小。二次項A2，B2和C2對解離度的線性效應均為極顯著。兩因素的交互影響中，AB不顯著，AC顯著，BC極顯著，說明A，B，C三項之間有交互作用，且相互影響非常復雜。同時，模型的F=37.92，p值極顯著，相關系數R2=0.979 9，表明模型的預測值與真實值之間有很高的相關性，校正相關系數為0.954 1，表示試驗所建立的模型可以解釋95.41%的響應值的變化，信噪比為17.245，變異系數為2.09%，表明該模型可信度高，誤差很小，能很好反映各因素與水解度的關系，可以用該模型預測螺旋藻蛋白的水解度。

表3 響應面方差分析

2.2.3 響應面分析

通過Design Expert 7.0軟件Model Graphs得到響應曲面三維圖。固定酶解溫度55 ℃，由圖5可知pH的影響更大。固定酶加入量4%，由圖6可知pH的影響更大。固定pH 6.5，由圖7可知酶加入量的影響更大。綜合上述結果，當某一因素確定為特定水平后，另外2個因素與水解度響應值之間均呈二次曲面關系，3個因素在各自的水平變化內均呈拋物線，隨著某一因素的增加，水解度增加，但達到一定值后，就會隨著其增加而減小，每一曲面中，水解度均有一最大值。

圖5 pH與酶加入量交互作用響應面三維圖

圖6 pH與酶解溫度交互作用響應面三維圖

圖7 酶解溫度與酶加入量交互作用響應面三維圖

2.2.4 相應因素水平的最優化

利用Design Expert 7.0軟件，通過Optimization下的Numerical對響應面模型進行數據的最優化處理，得到模型的優化工藝條件為A=6.40，B=4.22，C=54.99，Y=26.846 1，即當最適pH為6.40，酶加入量為4.22%，酶解溫度為54.99 ℃時，預測的水解度值最高，達到26.846 1%。為了在實際操作中更為簡便，實際試驗在pH 6.5、酶加入量4%、酶解溫度55 ℃條件下進行測定，其水解度為26.678 0%，與理論預測值十分接近，說明該模型所建立的二次回歸方程與實際情況擬合度高，可靠性良好，可以將其作為模型來預測水解度與最適pH、酶加入量和酶解溫度之間的關系。

3 結論

以水解度作為檢測螺旋藻蛋白質酶解程度的指標，通過單因素試驗，確定木瓜蛋白酶的水解度最高；堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解效果類似，居中；風味蛋白酶的水解度最差。選取對螺旋藻蛋白溶液水解效果最好的木瓜蛋白酶做多因素試驗，通過響應面分析，得到木瓜蛋白酶的最適反應條件，實際操作條件為：pH 6.5，酶加入量4%，酶解溫度55 ℃。此時水解度為26.678 0%，與模型預測值26.846 1%非常接近，預測模型可靠性高，可為螺旋藻蛋白質水解的相關研究以及實際生產等工作提供理論依據。