星點設計-效應面法優選陳皮健脾固體飲品的提取工藝

羅春花，馮露星，唐雨菲，李明慧，覃小麗，陳衛衛

廣西中醫藥大學（南寧 530200）

中醫理論認為，脾胃為氣血生化的源泉，脾為后天的根本，后天是元氣之本，元氣是身體健康的基礎[1]。陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的保健功效[2]；而蓮子可健脾益腎、養心安神[3]，兩者合用具有健脾祛濕、理氣安神等保健效果，使脾胃生化有力、氣血充足，可改善氣虛體質狀態。目前保健固體飲品已成為繼碳酸飲料、瓶裝水、果汁飲料之后迅速發展起來的一種健康飲品。此款飲品是通過引進多學科交叉技術經加工、調配（或不調配）等工藝制成的固體飲品，具有體積小、攜帶和運輸方便、包裝簡易、沖水速溶、飲用方便、易于保持衛生等特點，能滿足普通大眾甚至不健康人群保健養生的不同需求，故開發前景廣闊。試驗以陳皮、蓮子為主料，采用適宜技術最大程度提取功效成分、保留甘甜口感、去除不良氣味，擬開發出一款具有健脾祛濕、理氣安神等保健效果的固體飲品。陳皮、蓮子均屬食藥兩用植物，長期合理食用，不會產生急性、亞急性或者慢性危害，可滿足健康或亞健康人群“治未病”的需要。

在不改變傳統提取方法的基礎上，并考慮工業大生產的實際操作、成本等因素，故仍采用水煎煮法提取。橙皮苷為陳皮的主要有效成分，可反映該飲品的保健效果。故試驗以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中質量分數作為評價指標，以提取時間和加水倍數作為考察因素，用星點設計-效應面法優選陳皮健脾固體飲品的最佳提取工藝，具有實際意義，可為后續該產品的開發提供理論依據。

1 儀器、設備與試藥

1.1 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；101-2型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；CPA225D電子天平（北京賽多利斯系統儀器有限公司）；UPC-II-10T超純水器（四川優普超純科技有限公司）；HWS-8型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；98-1-B型電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：110721-201617）；藥材購自廣西仙茱中藥科技有限公司，由廣西中醫藥大學寧小清高級實驗師鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部要求；高效液相使用色譜純試劑，其余為分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 橙皮苷的測定

2.1.1 色譜條件

ODS-2 HYPERSIL色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，等度洗脫（洗脫程序如表1所示），流速為1.0 mL/min，檢測波長為283 nm，柱溫為30 ℃。

表1 流動相等度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液的制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度為0.4 mg/mL的橙皮苷對照品溶液，即可。

2.1.3 供試品溶液的制備

按處方量稱取藥材1份，加入10倍水，煎煮法提取1 h/次，共提取2次，濾過，合并濾液，定容。取適量濾液至離心管中，放至13 000 r/min高速離心機中離心，離心完成后，用潔凈的注射器吸取上清液，用0.22 μm水相微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

按處方稱取除陳皮外其他藥材，依“2.1.3”項下方法制備缺陳皮的陰性對照溶液。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 標準曲線的制備

精密吸取“2.1.2”項橙皮苷對照品溶液1，2，3，4，5和6 μL，分別注入高效液相色譜儀，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）（μg）為橫坐標，根據峰面積結果繪制標準曲線，并求得橙皮苷的線性回歸方程：Y橙皮苷=2.00×106X-17 072（r=0.999 9）。結果說明橙皮苷進樣量在0.400 0～2.400 0 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.1.5.2 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液（缺陳皮），按“2.1.1”項下的色譜條件進行測定。由圖1結果可知，對照品溶液中橙皮苷的色譜峰與供試品溶液中橙皮苷的色譜峰的出峰位置一致，陰性對照液色譜圖中在橙皮苷色譜峰位置不出峰，表明陰性對照液（缺陳皮）中無橙皮苷含量測定的干擾成分。結果見圖1。

2.1.5.3 精密度試驗

取“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.1.2”項下的色譜條件連續進樣6針，測定峰面積。結果顯示，色譜峰面積的RSD值為0.50%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.5.4 重復性試驗

按處方量稱取藥材，按“2.1.3”項方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，并計算RSD。結果顯示，橙皮苷含量平均值為0.632 4 mg/g，RSD值為1.85%（n=6），表明提取方法重復性良好。

圖1 陳皮健脾固體飲品的提取工藝專屬性試驗結果

2.1.5.5 穩定性試驗

稱取處方量藥材1份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，進樣體積為5 μL，以相同的方法分別測定供試品溶液的峰面積，測定時間點為0，4，8，12，24和36 h。結果顯示，色譜峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液在36 h內穩定。

2.1.5.6 加樣回收試驗

稱取處方量藥材9份，對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1和0.5∶1左右，每個比例平行操作3份，按“2.1.3”項下方法制備樣品溶液，根據“2.1.1”項下的色譜條件分別進樣，測定橙皮苷含量，計算出橙皮苷平均回收率分別為98.67%，93.96%和100.9%，RSD分別為2.44%，2.60%和1.73%。

2.1.5.7 樣品含量的測定

按處方量稱取3批不同批號藥材，按照“2.1.3”項方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”色譜條件，測定峰面積，計算橙皮苷的平均含量。結果得出：橙皮苷的平均含量為12.741 9 mg/g，RSD值為2.60%。

2.2 橙皮苷在干膏中質量分數的測定方法

精密吸取陳皮健脾固體飲品溶液10 mL，置于恒質量的蒸發皿中，水浴加熱將藥液揮發至不流動狀態，105 ℃干燥，置于干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定，直至干膏恒質量成功，并計算橙皮苷在干膏中質量分數。

橙皮苷在干膏中質量分數=M/G×100% （1）式中：M為供試品溶液中橙皮苷總質量，mg；G為供試品溶液的干膏總質量，mg。

2.3 星點試驗優化提取工藝條件

2.3.1 試驗設計

結合原方的提取方法、單因素試驗結果和實際生產經驗，采用水煎提取法，將提取次數定為2次，考察因素為加水倍數、提取時間。根據星點設計的原理，每個因素設5個水平，代碼值所代表的實際操作物理量見表2。

表2 因素代碼水平及對應物理量

試驗是以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中的質量分數為評價指標。數據處理方法為“歸一值”，各指標均標準化為0～1間的“歸一值”，各指標的“歸一值”求算幾何平均數，得總評“歸一值”，即OD=（d1×d2×d3）1/3。對于取值越大越好和越小越好的指標采用Hassan方法進行數學轉換求“歸一值”，試驗所用指標均要求越大越好，轉換公式為di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）。

2.3.2 星點設計結果

星點設計試驗安排及結果見表3。

表3 星點設計試驗及結果

2.3.3 模擬擬合

應用Design-Expert 8.0.6進行數據分析，以OD值為指標對各因素進行多元線性回歸，擬合方程為Y=-0.800 06+0.083 475X1+2.094 75×10-3X2（r=0.934 6，p＜0.000 1）。從擬合方程的相關系數可知，OD值與2個考察因素之間線性相關性結果不理想，因此該模型不合適，因此選擇采用多元二次項擬合分析。多元二次項擬合方程為Y=-1.6174 9+0.158 68X1+0.010 165X2-5.921 90×10-5X1X2-2.495 74×10-3X12-4.022 93×1（r=0.974 8，p＜0.000 1）。結果顯示非線性的r值更高，擬合效果更好。

2.3.4 方差分析

由表4可知，多元二項式回歸方程失擬檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾很小，模型擬合檢驗高度顯著，為成功模型。除X1X2、回歸系數不顯著外，其他均達到顯著水平。

表4 回歸模型方差分析結果

2.3.5 效應面優化和預測

采用星點設計軟件，得到陳皮健脾固體飲品的提取工藝的三維效應曲面圖和等高線圖，見圖2和圖3，由數據處理結果分析可得到優化提取工藝條件為加水量18.24倍、提取時間1.88 h，可預測出總評OD值為0.959 7。鑒于試驗操作的可行性，并結合工業大生產的實際操作可行性情況考慮，確定最佳工藝條件為加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次。

圖2 提取時間與加水倍數對總評歸一值影響的三維效應面圖

圖3 提取時間與加水倍數對總評歸一值影響的二維等高線圖

2.3.6 提取工藝的驗證試驗

按選取的最佳提取工藝：加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次，提取3批樣品，結果橙皮苷含量均值為20.300 4 mg/g，橙皮苷在干膏中質量分數均值為30.406 67%，實測OD值為0.997 2，與方程預測值比較，偏差率為-3.91%。表明所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件穩定性和重現性好。

3 討論

3.1 提取方法及考察因素的選擇

提取中藥是一個十分復雜的過程，對藥物的提取質量、有效成分的提取率產生影響的因素有很多，例如提取時間、提取溶劑、提取次數、提取溫度等，同時也會影響成藥療效[4]。綜合考慮能源的損耗、后續放大生產的合理性，故將提取次數定為2次。由于處方為傳統經驗方，考慮不改變原有煎煮方法，并且結合在大生產過程中需考慮成本等因素，故仍然采用水煎煮法提取。因現有試驗條件無法控制提取溫度，故選用提取時間和加水倍數作為考察因素。

3.2 評價指標的確定

陳皮健脾固體飲品處方中陳皮為君藥，陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，其主要含有橙皮苷[5]、柚皮苷和檸檬烯等成分。橙皮苷具有調節免疫力[6]、促胃腸動力[7]等藥理活性，能夠調節免疫功能，促進胃腸蠕動，從而起到健脾、理氣作用。脾胃強健，元氣充足，則能有效緩解氣虛癥狀，從而達到治療氣虛體質的效果。故采用陳皮的有效成分橙皮苷含量作為評價指標之一。

同時由于中藥復方成分復雜，干膏中含有有效成分及各種雜質成分，故不采用干膏率作為評價指標，干膏率越大不代表提取效果越好，也不代表有效成分含量就越大，因為干膏率大也可能是干膏中雜質成分較多，因此課題采用橙皮苷在干膏中的質量分數作為另一個評價指標，能夠更加科學地反映藥物提取效果，橙皮苷在干膏中質量分數越大，則干膏中有效成分含量越多，說明提取效果越好。

3.3 數據處理

在試驗設計優化法必須完成兩方面的工作：①正確描述結果或指標與各考察因素的關系，即建立合適的數學模擬方程。②依據數學方程選取較佳工藝。近年來常用優化工藝試驗設計方法有析因設計、正交設計、均勻設計、星點設計-效應面法[8]。

當因素與水平數量過多時，采用析因設計法造成試驗次數極高，極耗費人力和時間[9]；采用正交設計法時試驗次數會以水平數的平方倍數上升，從而導致在一定周期內試驗安排操作難度變大[10]；均勻設計法雖然可減少試驗次數，但同時易派生自變量，當自變量個數大于觀測點個數，得到的多重線性回歸方程不唯一，各結果彼此之間易出現不可抗差異[11-12]。

星點設計-效應面法是一種科學的、簡便易學的試驗設計優化方法，一般用的是二階設計，集數學和統計學為一體[13]，能夠得出科學、客觀的數據結果，星點設計試驗次數較正交試驗少，且試驗設計更為合理，試驗精度高，能夠直接利用軟件進行數據處理，并適用于多因素、多水平的試驗[14-16]。此外，能夠在軟件直接顯示試驗結果，并對最佳工藝條件進行預測，極大地降低了主觀因素對結果的影響。因此，試驗采用星點設計-效應面法優選陳皮健脾固體飲品的提取工藝，對最佳提取工藝進行驗證，結果表明實際值與預測值偏差在合理范圍內，表明該數學模型預測的結果真實可靠，為該產品后續的研究開發及工業化生產提供一定的理論基礎，具有實際應用價值。

4 結論

試驗采用星點設計-效應面法優選陳皮健脾固體飲品的提取工藝，并結合工業實際生產考慮，確定陳皮健脾固體飲品的最佳提取工藝為加水倍數18倍，提取時間120 min，提取2次。驗證試驗結果測得總評OD值為0.997 2，與理論預測值接近。表明星點設計-效應面法對陳皮健脾固體飲品的試驗指標具有較好的優選性和預測性，所得工藝方法簡單、穩定可靠。