桑葚花青素超聲波輔助提取工藝優化

衛春會，張蘭蘭，鄧杰，任志強，徐升東，程鐵轅

1. 四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室（宜賓 644000）；2. 四川省閬州圣果酒業有限公司（閬中 637400）；3. 宜賓海關（宜賓 644000）

桑葚（mulberry）又名桑果、烏葚、桑椹等，含有豐富的營養物質，被譽為“21世紀最佳保健果品”，具有滋陰補血、生津止渴、補肝益腎等功效[1-3]。桑葚果實味甜汁多，色澤艷麗，富含黃酮醇、花青素、維生素、胡蘿卜素、酚酸等多種生物活性物質，具有良好的保健功能[4-5]?；ㄇ嗨兀╝nthocyanidin）是桑葚中主要的生物活性物質，是一種天然色素，具有抗氧化、抗癌、降血糖、預防心血管疾病、減少脂肪生成等多種生理活性功能[6-14]。近年來，花青素在食品、藥品、保健食品領域方面應用廣泛，作為天然食源性防腐劑，主要用于延長食品保質期；作為食品調料，被廣泛用于各種日常食品如奶酪、飲料、酒等[15-17]。

近年來，花青素因與人體健康有著密切關系而廣受關注，國內外對桑葚花青素的提取及用處有了不少研究。花青素提取純化方法直接影響其研究及利用，目前花青素提取方法有超聲波提取法、微波提取法、溶有機溶劑提取法、超臨界流體萃取等[18]。江巖[19]利用溶劑浸提法從新疆藥桑椹中提取花青素，得到最佳工藝。Rodrigues等[20]采用響應面法對巴西嘉寶果皮的超聲輔助提取工藝進行優化。侯巧芝等[21]利用超聲波輔助提取法從甘蔗皮中提取花青素并對其抗氧化活性進行研究。

此次試驗以桑果干為研究對象，采用超聲波輔助提取法提取桑葚花青素，超聲波可以加速植物細胞壁的破壞而提高胞內物質提取得率，縮短提取時間[22]。通過探究不同的超聲功率、超聲時間、超聲溫度和料液比4個因素，確定較優工藝提取條件。此次試驗結果有助于提高花青素提取量，并為進一步利用和開發桑葚提供理論和數據的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

桑果干，來自四川省閬州圣果酒業有限公司。

1.1.2 主要試劑

95%乙醇、濃鹽酸、氯化鉀等均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

酶標儀（1500型），賽默飛世爾科技有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1200型），上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pH計（Starter2100型），奧豪斯儀器（上海）有限公司；粉碎機（BM255C型），廣東美的精品電器制造有限公司；干燥箱（LabServ.LS.0610型），飛世爾試驗器材（上海）有限公司；電子天平（AR2140型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉蒸發儀（RE-5203型），上海亞榮生化儀器廠；數控超聲波清洗器（KQ5200DB型），昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預處理

將桑果干置于烘箱中，在50 ℃下將桑果干烘干1 h，再使用粉碎機將其粉碎成粉末狀，得到桑葚粉末，過20目篩，放于干燥器密封儲藏，備用。

1.3.2 緩沖液的配制

pH 1.0緩沖液配制[23]：0.2 mol/L KCl和0.2 mol/L HCl的體積比為25∶67。

pH 4.5緩沖液配制：配制0.2 mol/L NaAc溶液，使用0.2 mol/L HCl調至pH 4.5±0.1。

1.3.3 測量其最大吸收波長

稱取5.0 g粉碎后的桑葚粉，用10 mL 50%乙醇浸提15 min，抽濾后得到花青素粗提取液。取5 mL花青素提取液，分別用pH 1.0氯化鉀緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液稀釋10倍，將稀釋液靜置15 min，用酶標儀在440～600 nm波長范圍內分別測定2種提取稀釋液，從440 nm開始的吸光度A，波峰處的波長為最大吸收波長，此處吸光度即Amax。

1.3.4 吸光度A及樣品花青素含量C的測定

花青素的含量測定采用pH示差法[24]。

式中：A為總吸光度；Amax為最大吸收波長的吸光度；A700為波長為700 cm的吸光度；ε為Cy-3-gLu的消光系數，其值為26 900 L·mol-1·cm-1；MW為Cy-3-Glu相對分子質量，其值為449.2 g/mol；DF為稀釋倍數；V為總取液體積，mL；Mt為樣品質量，g；L為光程，其值為1 cm。

1.3.5 工藝流程

桑葚果干→粉碎→過篩→超聲波輔助法→抽濾→取樣測定吸光度→計算含量→旋轉濃縮→冷凍干燥→花青素

1.4 超聲波輔助法提取桑葚花青素的單因素試驗設計

在前期的研究結果中，確定工藝條件：乙醇體積分數65%、pH 4[25]。稱取若干份1.0 g桑葚粉置于250 mL三角瓶中，分別在一定條件下，考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度、料液比4個因素對花青素提取量的影響。

1.4.1 料液比對桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲功率1 600 W、超聲時間20 min、乙醇體積分數65%、pH 4的條件下，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）對桑葚花青素提取量的影響。

1.4.2 不同超聲波功率對桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數65%、pH 4的條件下，考察超聲波功率800，1 200，1 600和2 000 W對桑葚花青素提取量的影響。

1.4.3 不同超聲波溫度對桑葚花青素提取量的影響

在超聲功率1 600 W、超聲時間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數65%、pH 4的條件下，考察超聲溫度40，50，60和70 ℃對桑葚花青素提取量的影響。

1.4.4 超聲時間對桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲功率1 600 W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數65%、pH 4的條件下，考察超聲時間10，20，30和40 min對桑葚花青素提取量的影響。

1.5 正交試驗設計

依據單因素試驗的結果，選取4個單因素合適的3個水平對桑葚花青素超聲輔助提取工藝條件進行優化。選擇超聲功率、超聲時間、料液比為變量，增加空白項，以桑葚花青素提取量為評價指標，每組3個平行，設計四因素三水平L9(34)的正交試驗，從而確定提取桑葚花青素最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 花青素最大吸收波長的確定

基于之前對桑葚花青素乙醇浸提工藝優化試驗的研究，確定2條折線均在波長530 nm處出現波峰，吸光度達到最大，結果如圖1所示。因此，此次試驗選擇采用波長530 nm以測定提取液的吸光度，并通過pH示差法計算桑葚花青素樣品的吸光度與花青素含量。

2.2 單因素條件對桑葚花青素含量的影響

2.2.1 料液比對桑葚花青素提取量的影響

如圖2所示，隨著料液比的增加，花青素提取量呈現先增后降的趨勢，當料液比為1∶20（g/mL）時，花青素提取量達到最大值。這是由于隨著料液比的增加，溶液與花青素接觸面積越大，花青素進入溶液量越多，得率越高[26]。因此，選擇料液比1∶20（g/mL）。

圖1 桑葚花青素最大吸收波長測定曲線

圖2 不同料液比對花青素提取量的影響

2.2.2 超聲波功率對桑葚花青素提取量的影響

如圖3所示，超聲波功率在800～1 600 W之間，桑葚中花青素提取量先緩慢降低再增加，當超聲功率為1 600 W時，提取量達到最大，繼續增加超聲功率，提取量減小。這是因為超聲波破壞了花青素結構，導致花青素提取減少[27]。故試驗選擇超聲波功率1 600 W。

圖3 不同超聲波功率對花青素提取量的影響

2.2.3 超聲溫度對桑葚花青素提取量的影響

如圖4所示，隨著超聲波溫度的增加，花青素提取量增加，當超聲溫度達到50 ℃時，花青素含量達到最大值，這是因為隨著超聲溫度的升高，細胞膜的透性增強，這有利于花青素的浸出[28]。但是，溫度繼續升高，花青素提取量降低，主要是因為高溫容易導致花青素被氧化或降解[29]。因此，選擇最佳超聲溫度50 ℃。

2.2.4 超聲時間對桑葚花青素提取量的影響

如圖5所示，隨著超聲時間的增加，桑葚花青素的提取量先增后降，當超聲時間達到20 min時，花青素含量達到最大值，這是因為體系中存在濃度差，花青素溶出速度快。繼續增加超聲時間，花青素提取量下降，影響原因在于花青素本身易被氧化，超聲時間較長會造成析出花青素被氧化[30]。因此，選擇超聲時間20 min。

圖4 不同超聲溫度對花青素提取量的影響

圖5 不同超聲時間對花青素提取量的影響

2.3 桑葚花青素提取正交試驗及結果

通過對超聲功率、超聲溫度、超聲時間、料液比4個因素進行單因素試驗，初步揭示這些因素對桑葚花青素提取量的影響。對比單因素試驗結果，桑葚花青素提取量隨超聲功率、超聲時間、料液比3個因素變化的趨勢較為明顯。因此選擇超聲功率（A）、超聲時間（B）、料液比（C）為變量。

在超聲溫度50 ℃的條件下，以桑葚花青素提取量為評價指標，設定四因素三水平L9(34)正交試驗，正交試驗結果見表1。為進一步確認各試驗因素的可信度，對桑葚花青素提取的正交試驗結果進行了方差分析，結果見表2。

由表1可知，根據極差值得到變量對花青素提取量高低的影響順序為超聲時間（B）＞超聲功率（A）＞料液比（C）；通過極差分析得到桑葚花青素提取量的最佳工藝條件組合為A2B2C1，即超聲時間為20 min、超聲功率為1 600 W、料液比為1∶10（g/mL）。由表2可知，超聲時間對試驗結果有顯著影響（p＜0.05）。超聲功率與料液比對試驗結果無明顯影響（p＞0.05）。

2.4 工藝驗證

由于直觀分析得到的最優工藝條件為A3B2C1，花青素含量為2.80 mg/g，故對上述正交試驗的最佳工藝條件A2B2C1進行工藝驗證試驗，在超聲溫度50 ℃的條件下，進行5組平行試驗，結果如表3所示。結果顯示，正交試驗最佳工藝提取的桑葚花青素含量為2.88 mg/g，故最佳提取條件組合為A2B2C1，即超聲功率為1 600 W、超聲時間為20 min、料液比1∶10（g/mL）。

表1 超聲波輔助法提取正交表

表2 超聲波輔助法提取方差分析表

表3 超聲波輔助提取法驗證試驗結果

3 結論

單因素試驗和正交試驗表明，超聲功率、超聲時間、料液比3個因素對桑葚花青素的提取量影響較大，其中超聲時間對花青素提取量最為顯著（p＜0.05）。根據桑葚花青素正交試驗極差大小得到各因素對花青素提取量的影響：超聲時間＞超聲功率＞料液比。綜合分析，最優工藝組合為A2B2C1，即超聲時間為20 min、超聲功率為1 600 W、料液比為1∶10（g/mL）。在此條件下，桑葚花青素提取量為2.88 mg/g。

采用超聲波輔助提取法，提取量相對較高，操作簡單易于控制，且提取時間短，節能環保，在實驗室與工業生產上均可推行，是一種很具有應用前景的花青素提取方法。此次試驗確定了超聲波輔助法提取桑葚花青素的工藝條件，該工藝條件后續將對桑葚花青素純化進行研究，為桑葚花青素的工業生產提供技術支撐。