桑葚花青素超聲波輔助提取工藝優(yōu)化

衛(wèi)春會(huì)，張?zhí)m蘭，鄧杰，任志強(qiáng)，徐升東，程鐵轅

1. 四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜賓 644000）；2. 四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司（閬中 637400）；3. 宜賓海關(guān)（宜賓 644000）

桑葚（mulberry）又名桑果、烏葚、桑椹等，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被譽(yù)為“21世紀(jì)最佳保健果品”，具有滋陰補(bǔ)血、生津止渴、補(bǔ)肝益腎等功效[1-3]。桑葚果實(shí)味甜汁多，色澤艷麗，富含黃酮醇、花青素、維生素、胡蘿卜素、酚酸等多種生物活性物質(zhì)，具有良好的保健功能[4-5]?；ㄇ嗨兀╝nthocyanidin）是桑葚中主要的生物活性物質(zhì)，是一種天然色素，具有抗氧化、抗癌、降血糖、預(yù)防心血管疾病、減少脂肪生成等多種生理活性功能[6-14]。近年來(lái)，花青素在食品、藥品、保健食品領(lǐng)域方面應(yīng)用廣泛，作為天然食源性防腐劑，主要用于延長(zhǎng)食品保質(zhì)期；作為食品調(diào)料，被廣泛用于各種日常食品如奶酪、飲料、酒等[15-17]。

近年來(lái)，花青素因與人體健康有著密切關(guān)系而廣受關(guān)注，國(guó)內(nèi)外對(duì)桑葚花青素的提取及用處有了不少研究。花青素提取純化方法直接影響其研究及利用，目前花青素提取方法有超聲波提取法、微波提取法、溶有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取等[18]。江巖[19]利用溶劑浸提法從新疆藥桑椹中提取花青素，得到最佳工藝。Rodrigues等[20]采用響應(yīng)面法對(duì)巴西嘉寶果皮的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。侯巧芝等[21]利用超聲波輔助提取法從甘蔗皮中提取花青素并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。

此次試驗(yàn)以桑果干為研究對(duì)象，采用超聲波輔助提取法提取桑葚花青素，超聲波可以加速植物細(xì)胞壁的破壞而提高胞內(nèi)物質(zhì)提取得率，縮短提取時(shí)間[22]。通過(guò)探究不同的超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和料液比4個(gè)因素，確定較優(yōu)工藝提取條件。此次試驗(yàn)結(jié)果有助于提高花青素提取量，并為進(jìn)一步利用和開(kāi)發(fā)桑葚提供理論和數(shù)據(jù)的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

桑果干，來(lái)自四川省閬州圣果酒業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

95%乙醇、濃鹽酸、氯化鉀等均為分析純，購(gòu)自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（1500型），賽默飛世爾科技有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1200型），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)（Starter2100型），奧豪斯儀器（上海）有限公司；粉碎機(jī)（BM255C型），廣東美的精品電器制造有限公司；干燥箱（LabServ.LS.0610型），飛世爾試驗(yàn)器材（上海）有限公司；電子天平（AR2140型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-5203型），上海亞榮生化儀器廠；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DB型），昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 預(yù)處理

將桑果干置于烘箱中，在50 ℃下將桑果干烘干1 h，再使用粉碎機(jī)將其粉碎成粉末狀，得到桑葚粉末，過(guò)20目篩，放于干燥器密封儲(chǔ)藏，備用。

1.3.2 緩沖液的配制

pH 1.0緩沖液配制[23]：0.2 mol/L KCl和0.2 mol/L HCl的體積比為25∶67。

pH 4.5緩沖液配制：配制0.2 mol/L NaAc溶液，使用0.2 mol/L HCl調(diào)至pH 4.5±0.1。

1.3.3 測(cè)量其最大吸收波長(zhǎng)

稱取5.0 g粉碎后的桑葚粉，用10 mL 50%乙醇浸提15 min，抽濾后得到花青素粗提取液。取5 mL花青素提取液，分別用pH 1.0氯化鉀緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液稀釋10倍，將稀釋液靜置15 min，用酶標(biāo)儀在440～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)定2種提取稀釋液，從440 nm開(kāi)始的吸光度A，波峰處的波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)，此處吸光度即Amax。

1.3.4 吸光度A及樣品花青素含量C的測(cè)定

花青素的含量測(cè)定采用pH示差法[24]。

式中：A為總吸光度；Amax為最大吸收波長(zhǎng)的吸光度；A700為波長(zhǎng)為700 cm的吸光度；ε為Cy-3-gLu的消光系數(shù)，其值為26 900 L·mol-1·cm-1；MW為Cy-3-Glu相對(duì)分子質(zhì)量，其值為449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為總?cè)∫后w積，mL；Mt為樣品質(zhì)量，g；L為光程，其值為1 cm。

1.3.5 工藝流程

桑葚果干→粉碎→過(guò)篩→超聲波輔助法→抽濾→取樣測(cè)定吸光度→計(jì)算含量→旋轉(zhuǎn)濃縮→冷凍干燥→花青素

1.4 超聲波輔助法提取桑葚花青素的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期的研究結(jié)果中，確定工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 4[25]。稱取若干份1.0 g桑葚粉置于250 mL三角瓶中，分別在一定條件下，考察超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比4個(gè)因素對(duì)花青素提取量的影響。

1.4.1 料液比對(duì)桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲功率1 600 W、超聲時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 4的條件下，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.2 不同超聲波功率對(duì)桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 4的條件下，考察超聲波功率800，1 200，1 600和2 000 W對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.3 不同超聲波溫度對(duì)桑葚花青素提取量的影響

在超聲功率1 600 W、超聲時(shí)間20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 4的條件下，考察超聲溫度40，50，60和70 ℃對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.4.4 超聲時(shí)間對(duì)桑葚花青素提取量的影響

在超聲溫度40 ℃、超聲功率1 600 W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 4的條件下，考察超聲時(shí)間10，20，30和40 min對(duì)桑葚花青素提取量的影響。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取4個(gè)單因素合適的3個(gè)水平對(duì)桑葚花青素超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇超聲功率、超聲時(shí)間、料液比為變量，增加空白項(xiàng)，以桑葚花青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每組3個(gè)平行，設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)，從而確定提取桑葚花青素最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定

基于之前對(duì)桑葚花青素乙醇浸提工藝優(yōu)化試驗(yàn)的研究，確定2條折線均在波長(zhǎng)530 nm處出現(xiàn)波峰，吸光度達(dá)到最大，結(jié)果如圖1所示。因此，此次試驗(yàn)選擇采用波長(zhǎng)530 nm以測(cè)定提取液的吸光度，并通過(guò)pH示差法計(jì)算桑葚花青素樣品的吸光度與花青素含量。

2.2 單因素條件對(duì)桑葚花青素含量的影響

2.2.1 料液比對(duì)桑葚花青素提取量的影響

如圖2所示，隨著料液比的增加，花青素提取量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，花青素提取量達(dá)到最大值。這是由于隨著料液比的增加，溶液與花青素接觸面積越大，花青素進(jìn)入溶液量越多，得率越高[26]。因此，選擇料液比1∶20（g/mL）。

圖1 桑葚花青素最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定曲線

圖2 不同料液比對(duì)花青素提取量的影響

2.2.2 超聲波功率對(duì)桑葚花青素提取量的影響

如圖3所示，超聲波功率在800～1 600 W之間，桑葚中花青素提取量先緩慢降低再增加，當(dāng)超聲功率為1 600 W時(shí)，提取量達(dá)到最大，繼續(xù)增加超聲功率，提取量減小。這是因?yàn)槌暡ㄆ茐牧嘶ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花青素提取減少[27]。故試驗(yàn)選擇超聲波功率1 600 W。

圖3 不同超聲波功率對(duì)花青素提取量的影響

2.2.3 超聲溫度對(duì)桑葚花青素提取量的影響

如圖4所示，隨著超聲波溫度的增加，花青素提取量增加，當(dāng)超聲溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，花青素含量達(dá)到最大值，這是因?yàn)殡S著超聲溫度的升高，細(xì)胞膜的透性增強(qiáng)，這有利于花青素的浸出[28]。但是，溫度繼續(xù)升高，花青素提取量降低，主要是因?yàn)楦邷厝菀讓?dǎo)致花青素被氧化或降解[29]。因此，選擇最佳超聲溫度50 ℃。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)桑葚花青素提取量的影響

如圖5所示，隨著超聲時(shí)間的增加，桑葚花青素的提取量先增后降，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，花青素含量達(dá)到最大值，這是因?yàn)轶w系中存在濃度差，花青素溶出速度快。繼續(xù)增加超聲時(shí)間，花青素提取量下降，影響原因在于花青素本身易被氧化，超聲時(shí)間較長(zhǎng)會(huì)造成析出花青素被氧化[30]。因此，選擇超聲時(shí)間20 min。

圖4 不同超聲溫度對(duì)花青素提取量的影響

圖5 不同超聲時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響

2.3 桑葚花青素提取正交試驗(yàn)及結(jié)果

通過(guò)對(duì)超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，初步揭示這些因素對(duì)桑葚花青素提取量的影響。對(duì)比單因素試驗(yàn)結(jié)果，桑葚花青素提取量隨超聲功率、超聲時(shí)間、料液比3個(gè)因素變化的趨勢(shì)較為明顯。因此選擇超聲功率（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）為變量。

在超聲溫度50 ℃的條件下，以桑葚花青素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。為進(jìn)一步確認(rèn)各試驗(yàn)因素的可信度，對(duì)桑葚花青素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表1可知，根據(jù)極差值得到變量對(duì)花青素提取量高低的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間（B）＞超聲功率（A）＞料液比（C）；通過(guò)極差分析得到桑葚花青素提取量的最佳工藝條件組合為A2B2C1，即超聲時(shí)間為20 min、超聲功率為1 600 W、料液比為1∶10（g/mL）。由表2可知，超聲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（p＜0.05）。超聲功率與料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響（p＞0.05）。

2.4 工藝驗(yàn)證

由于直觀分析得到的最優(yōu)工藝條件為A3B2C1，花青素含量為2.80 mg/g，故對(duì)上述正交試驗(yàn)的最佳工藝條件A2B2C1進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，在超聲溫度50 ℃的條件下，進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，正交試驗(yàn)最佳工藝提取的桑葚花青素含量為2.88 mg/g，故最佳提取條件組合為A2B2C1，即超聲功率為1 600 W、超聲時(shí)間為20 min、料液比1∶10（g/mL）。

表1 超聲波輔助法提取正交表

表2 超聲波輔助法提取方差分析表

表3 超聲波輔助提取法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)表明，超聲功率、超聲時(shí)間、料液比3個(gè)因素對(duì)桑葚花青素的提取量影響較大，其中超聲時(shí)間對(duì)花青素提取量最為顯著（p＜0.05）。根據(jù)桑葚花青素正交試驗(yàn)極差大小得到各因素對(duì)花青素提取量的影響：超聲時(shí)間＞超聲功率＞料液比。綜合分析，最優(yōu)工藝組合為A2B2C1，即超聲時(shí)間為20 min、超聲功率為1 600 W、料液比為1∶10（g/mL）。在此條件下，桑葚花青素提取量為2.88 mg/g。

采用超聲波輔助提取法，提取量相對(duì)較高，操作簡(jiǎn)單易于控制，且提取時(shí)間短，節(jié)能環(huán)保，在實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)生產(chǎn)上均可推行，是一種很具有應(yīng)用前景的花青素提取方法。此次試驗(yàn)確定了超聲波輔助法提取桑葚花青素的工藝條件，該工藝條件后續(xù)將對(duì)桑葚花青素純化進(jìn)行研究，為桑葚花青素的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。