黃秋葵多糖的提取純化及其噴霧干燥粉的開(kāi)發(fā)

王坤立，傅嬈，李貝，倪元穎

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）；2. 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心（北京 100083）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）別名秋葵、羊角豆、洋辣椒，屬于錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（AbelmoschusMedic），為一年生草本植物[1]。黃秋葵在中國(guó)種植面積逐漸擴(kuò)大，是一種有較大經(jīng)濟(jì)潛力的新型蔬菜。研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵嫩莢中含有豐富的黏性多糖物質(zhì)，主要是由阿拉伯聚糖、鼠李糖、半乳聚糖、果膠類(lèi)多糖及少量糖蛋白組成的混合物[1-2]。黏液是黃秋葵最突出的特點(diǎn)，此黏液可以助消化、防便秘、促進(jìn)膽固醇物質(zhì)排出體外、治療胃炎、保護(hù)腸胃，潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、增強(qiáng)身體抵抗力、抗疲勞[3-4]。多糖是一種大分子化合物，具有非常重要的生物功能，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品功能化學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一[5-6]。多糖大多采用熱水浸泡提取[7]，但熱水浸提存在時(shí)間長(zhǎng)、得率低的缺點(diǎn)。

隨著國(guó)民的健康意識(shí)越來(lái)越強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)保健成為廣大人民群眾的基本需求之一。保健食品的功能也擴(kuò)展到各種生物活性功能，如抗疲勞、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等[8]。然而除了市場(chǎng)上出現(xiàn)的黃秋葵凍干食品、黃秋葵罐頭、黃秋葵餅干、黃秋葵酸奶等加工產(chǎn)品，黃秋葵的保健產(chǎn)品種類(lèi)較少，因此具有很大開(kāi)發(fā)空間。

采用超聲輔助熱水提取黃秋葵多糖，其效率較傳統(tǒng)熱水浸提法有顯著提高；鑒定黃秋葵多糖功能性多糖組分；研制黃秋葵多糖噴霧干燥粉，篩選多糖粉輔料，對(duì)多糖粉的收率、抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)旨在為黃秋葵的深加工、黃秋葵保健品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵（產(chǎn)于青海省貴德縣，冷凍運(yùn)輸，-60 ℃凍存）。

DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B填料（Pharmacia公司）；葡聚糖T-series標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，Sigma公司）；麥芽糊精、β-環(huán)糊精、可溶性淀粉、卵磷脂、氫氧化鈣（均為食品級(jí)，廣州嘉德樂(lè)生化科技有限公司）；總抗氧化能力測(cè)定試劑（南京建成生物工程研究所）；其余試劑（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；TH-500A梯度混合器（上海青浦滬西儀器廠）；HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）；BSZ-100自動(dòng)部份收集器（上海滬西分析儀器廠）；Nicolet Nexus FT-IR紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Electron公司）；DSH水分活度測(cè)定儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；FB-110F1500ML噴霧干燥機(jī)（上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備工程有限公司）；Finnigan Trace GC-2000氣相色譜儀（美國(guó)Finnigan公司）；Finnigan DSQ質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司）；高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃秋葵粗多糖的提取純化

提取：參照Wang等[9]的方法進(jìn)行黃秋葵粗多糖（ROP）的提取。ROP得率計(jì)算如式（1）。

ROP得率=粗多糖凍干粉質(zhì)量（g）/提取用黃秋葵干粉質(zhì)量（g）×100% （1）

純化：準(zhǔn)確稱(chēng)取ROP 70.0 mg，溶于21 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)孔徑0.45 μm混合纖維素微孔膜過(guò)濾。將處理好的樣品溶液緩慢上樣于DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱（2.6 cm×20 cm），吸附20 min。依次用150 mL緩沖液洗脫、200 mL含0～0.6 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，洗脫速度4 mL/min，8 mL/tube收集。采用苯酚-硫酸法測(cè)定樣品液中的糖含量[10-11]。根據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰，用扁平寬度26 mm、透過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析袋透析72 h，凍干。

1.3.2 黃秋葵粗多糖組分純度鑒定

凝膠柱層析檢測(cè)：準(zhǔn)確稱(chēng)取多糖樣品10.0 mg，溶于4 mL微濾水中，經(jīng)孔徑0.22 μm混合纖維素微孔膜過(guò)濾，上樣于Sepharose CL-6B凝膠柱。用0.15 mol/L NaCl的微濾水以1 mL/min，4.0 mL/tube洗脫樣品。采用苯酚-硫酸法測(cè)定洗脫液中的糖含量。根據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰，透析（方法同1.3.1），凍干。

高效液相色譜檢測(cè)：使用Shodex SB-805HQ色譜柱，以0.1 mol/L NaNO3為流動(dòng)相，柱溫38 ℃、進(jìn)樣量20 μL、體積流量0.8 mL/min、檢測(cè)池溫度45 ℃。用KANUER示差折光檢測(cè)器跟蹤檢測(cè)，得到樣品在色譜柱中的保留峰。用葡聚糖T-系列標(biāo)準(zhǔn)品：T-1（1 kDa），T-7（7 kDa），T-10（10 kDa），T-40（40 kDa），T-500（500 kDa），T-1000（1 000 kDa）作標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。根據(jù)標(biāo)品的保留時(shí)間（x）和其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得方程為y=-1.282 7x+20.136（R2=0.998 9）。

1.3.3 黃秋葵粗多糖組分的單糖組成分析

參照Li等[13]方法，取2 mg黃秋葵粗多糖組分樣品進(jìn)行前處理。GC-MS色譜條件：采用Agilent公司的GC-MS分析儀進(jìn)行分析，DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱溫50 ℃，100 ℃（15 ℃/min）、170 ℃（10 ℃/min）、300 ℃（3 ℃/min）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，以He作載氣，進(jìn)樣量0.5 μL，流速0.8 mL/min，分流比1∶30；質(zhì)譜條件為電子轟擊源EI，電子能量70 eV，倍增器電壓350 V，接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍10～800 amu。

1.3.4 黃秋葵多糖噴霧干燥粉的開(kāi)發(fā)

稱(chēng)取一定量過(guò)孔徑0.425 mm篩的黃秋葵凍干粉[14]，經(jīng)脫脂、脫游離糖的前處理，分別按照1∶30（g/mL）的料液比加入去離子水，用飽和石灰水調(diào)節(jié)至pH 7.6±0.3。在功率522 W、溫度59 ℃下超聲30 min，以8 000 r/min離心8 min，取上清液。重復(fù)超聲提取操作3次，將上清液合并，減壓濃縮[9]。在進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速21 r/min，通針8 s（通針間隔指2次噴霧的間隔時(shí)間），風(fēng)速50 Hz，進(jìn)氣壓力0.5 MPa，添加7.5%卵磷脂，固形物含量1.1%條件下，考察不添加助干劑以及添加量為總固形物含量40%的不同助干劑（麥芽糊精、β-環(huán)糊精及可溶性淀粉）對(duì)產(chǎn)品噴霧干燥的綜合影響。

1.3.4.1 噴霧干燥工藝單因素試驗(yàn)

在風(fēng)速50 Hz，進(jìn)氣壓力0.5 MPa，添加7.5%卵磷脂，固形物含量1.1%條件下，分別考察β-環(huán)糊精添加量（10%，20%，30%，40%和50%）、進(jìn)風(fēng)溫度（150，160，170，180和190 ℃）、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速（17，19，21，23和25 r/min）、通針間隔（2，6，10，14和18 s）等對(duì)產(chǎn)品噴霧干燥的綜合影響。評(píng)價(jià)主要從含水率、粉末收率、抗氧化保留率和噴霧效果4個(gè)方面進(jìn)行[15]。噴霧干燥粉末的含水率通過(guò)DSH水分活度測(cè)定儀測(cè)得。

粉末收率=噴霧干燥粉末質(zhì)量（g）/噴霧干燥液固形物含量（g）×100% （2）

具體評(píng)分方法為含水率、粉末收率和抗氧化保留率中的最大值定為10分，3項(xiàng)中其余的按照其與最大值的比例分別評(píng)分，最終的綜合評(píng)分結(jié)果等于3個(gè)指標(biāo)的分值相加。噴霧效果則通過(guò)感官評(píng)定。

1.3.4.2 噴霧干燥工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精添加量、進(jìn)風(fēng)溫度和通針間隔3個(gè)因素對(duì)黃秋葵多糖液噴霧干燥效果的影響最大。以這3個(gè)因素為自變量，以單因素試驗(yàn)得出的各個(gè)最佳條件為中心點(diǎn)，以黃秋葵多糖噴霧干燥粉的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)方案，詳細(xì)條件見(jiàn)表1。

表1 噴霧干燥試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 總抗氧化能力測(cè)定

采用南京建成總抗氧化能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行多糖干粉的抗氧化能力測(cè)定。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.004 48x+0.018 42（R2=0.997）。

總抗氧化能力定義：37 ℃時(shí)，與0.4 mL 10 mg/mL的樣品有相同吸光度（抗氧化效果）的抗壞血酸的量為總抗氧化能力（μg）。

抗氧化保留率=樣品的總抗氧化能力/黃秋葵多糖噴霧干燥原料的抗氧化能力×100% （3）

1.3.6 傅里葉紅外光譜掃描

參照Woo[15]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。將黃秋葵多糖ROP-2與OPSP的紅外光譜掃描圖進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20分析軟件及Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。顯著水平p=0.05，p＜0.05時(shí)，表示存在顯著性差異。采用Origin 9進(jìn)行圖形處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵粗多糖的提取及純化

ROP的得率為10.35%，其中多糖含量為47.92%，蛋白質(zhì)含量為2.13%。試驗(yàn)結(jié)果與已報(bào)道的熱水提取工藝[16]相比較，提取溫度下降31 ℃，提取時(shí)間縮短10 h，得率提高64.15%。

ROP的洗脫曲線如圖1，對(duì)其3個(gè)主要的峰分別命名為ROP-1、ROP-2和ROP-3。由去離子水洗脫得到ROP-1，由濃度約0.15 mol/L和0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫分別得到ROP-2和ROP-3。結(jié)果表明，試驗(yàn)獲得的3種黃秋葵多糖組分中，ROP-2是中性多糖，ROP-1、ROP-3為酸性多糖。由于實(shí)際操作中ROP-1和ROP-3的得率過(guò)低，無(wú)法收集，故僅對(duì)ROP-2進(jìn)行收集研究。進(jìn)樣量70.00 mg，收集ROP-2 26.74 mg，得率為38.2%。

2.2 黃秋葵粗多糖組分純度鑒定

對(duì)ROP-2進(jìn)行凝膠柱（Sepharose CL-6B）[17]和HPLC法[18]進(jìn)行純度鑒定。從圖2和圖3均可以看出，ROP-2的洗脫曲線均為單一對(duì)稱(chēng)峰，可以證明其為均一組分。圖3中ROP-2出峰時(shí)間為11.58 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-1.282 7x+20.136（R2=0.998 9）計(jì)算可以得出ROP-2的相對(duì)分子質(zhì)量為1.92×105Da。

圖1 離子交換層析結(jié)果

圖2 ROP-2 Sepharose CL-6B凝膠過(guò)濾曲線

圖3 ROP-2的HPLC洗脫曲線

2.3 黃秋葵粗多糖組分的單糖組成分析

通過(guò)GC-MS分析表明，ROP-2主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、鼠李糖組成。

2.4 黃秋葵多糖噴霧干燥粉助干劑的選擇

從表2可知，與未添加助干劑的樣品相比，3種助干劑均可大幅降低OPSP含水率并可提粉末收率。這主要是由于糖類(lèi)玻璃化轉(zhuǎn)化溫度較低，黃秋葵多糖液糖類(lèi)物質(zhì)含量較高，而3種助干劑均可提高樣品的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度，使霧滴顆粒容易轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，從而提高粉末收率[19]。此外，助干劑為β-環(huán)糊精時(shí)，黃秋葵多糖噴霧干燥粉抗氧化保留率最高，達(dá)到83.64%±1.23%。這可能是由于β-環(huán)糊精是聚合度為7的低聚糖，其結(jié)構(gòu)具有高度的對(duì)稱(chēng)性，呈圓筒形立體結(jié)構(gòu)，分子中的糖苷鍵是共平面，疏水性基團(tuán)在環(huán)內(nèi)，親水性基團(tuán)在環(huán)外，可使β-環(huán)糊精很容易包裹樣品中的抗氧化活性物質(zhì)，從而保護(hù)其不被高溫破壞[20]。綜合4項(xiàng)指標(biāo)，采用β-環(huán)糊精作為黃秋葵多糖液的噴霧干燥助干劑。

表2 不同助干劑對(duì)噴霧干燥效果的影響

2.5 噴霧干燥工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同β-環(huán)糊精添加量的試驗(yàn)結(jié)果（圖4A）表明，隨著添加量增加，OPSP的含水率下降，粉末收率明顯上升。抗氧化保留率先上升，在40%添加量時(shí)達(dá)到最大值83.64%±1.23%，隨后稍有下降。這可能是因?yàn)樘砑恿吭龃螅瑢?duì)黃秋葵多糖的保護(hù)效果增強(qiáng)，故抗氧化保留率上升。但添加量過(guò)大會(huì)降低干粉中的多糖比例，故抗氧化保留率在較高添加量下成下降趨勢(shì)。從圖4A可以看出，在40%添加量時(shí)達(dá)到最大分值28.40±1.95，即噴霧干燥綜合效果最好。隨著添加量增大，噴霧效果有明顯改善，掛壁情況減輕、粉末分散性好、色澤佳。故選擇30%，40%和50%這3個(gè)添加量進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

隨著溫度的升高，OPSP含水率明顯下降，粉末收率則先上升后下降；抗氧化保留率隨著溫度的升高顯著降低，推測(cè)是高溫破壞了多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)而降低其抗氧化活性。從圖4B看出，進(jìn)風(fēng)溫度在170 ℃時(shí)綜合評(píng)分達(dá)27.83±1.37。溫度較低時(shí)，有粘壁現(xiàn)象，隨著溫度上升，粘壁現(xiàn)象減輕、粉末分散性變好。但在190 ℃的高溫下，多糖干粉有輕微焦糊現(xiàn)象。綜合上述分析，選擇160，170和180 ℃這3個(gè)進(jìn)風(fēng)溫度進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

隨著蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速加快，OPSP含水率升高，粉末收率和抗氧化保留率都成先升高后降低的趨勢(shì)。因?yàn)檗D(zhuǎn)速越高，進(jìn)料速度越快，樣品中水分蒸發(fā)不完全，粘壁現(xiàn)象也較其他條件嚴(yán)重。圖4C為不同蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速的分?jǐn)?shù)，在21 r/min時(shí)綜合評(píng)分顯著高于其他4個(gè)條件下的總分，達(dá)到28.82±1.57分，其他4個(gè)條件總分無(wú)顯著性差異。因此，選定21 r/min為噴霧干燥的蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速。

隨著通針間隔增長(zhǎng)，各含水率之間無(wú)顯著性差異，粉末收率則呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)。通針間隔短，噴霧壓力小，多糖液霧化顆粒無(wú)法形成，或形成的液滴顆粒直徑較大、比表面積小，熱交換不充分，故難以達(dá)到物料的玻璃化溫度，從而導(dǎo)致粉末收率較?。煌ㄡ橀g隔大于14 s時(shí)，所形成的霧化液滴雖然水分蒸發(fā)面積大、熱交換充分，但由于顆粒小，容易被熱空氣帶走，粉末收率反而下降[20]。通針間隔過(guò)高或過(guò)低，都使得粘壁現(xiàn)象加重，噴霧效果相對(duì)較差。由圖4D可知，綜合評(píng)分呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，10 s時(shí)分?jǐn)?shù)最大，為29.16±0.37。因此，選擇6，10和14 s 3個(gè)通針間隔進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖4 噴霧干燥工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.6 噴霧干燥工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)中β-環(huán)糊精（A）、進(jìn)風(fēng)溫度（B）和通針間隔（C）對(duì)噴霧干燥總分?jǐn)?shù)的影響進(jìn)行分析，以含水率、粉末收率和抗氧化保留率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。由表3知，各因素的影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C（進(jìn)風(fēng)溫度＞β-環(huán)糊精添加量＞通針間隔）。由表4知，β-環(huán)糊精添加量和進(jìn)風(fēng)溫度的3個(gè)水平的變動(dòng)均對(duì)噴霧干燥總分?jǐn)?shù)有顯著性影響（pβ-環(huán)糊精添加量＜0.05，p進(jìn)風(fēng)溫度＜0.01）；通針間隔（C）的F＜9，表明該因素的3個(gè)水平的變動(dòng)對(duì)噴霧干燥總分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著性影響。通過(guò)極差分析，可以確定正交試驗(yàn)最佳組合為A2B2C1，最佳工藝條件為添加40%的β-環(huán)糊精，進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃，通針間隔6 s。經(jīng)驗(yàn)證，在所得最佳工藝條件下，含水率3.29%，粉末得率45.26%，抗氧化保留率83.31%，總得分29.39分。

2.7 傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果

ROP-2與OPSP的紅外掃描圖譜重合性較高（圖5），說(shuō)明噴霧干燥沒(méi)有給黃秋葵多糖的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)造成太大改變。試驗(yàn)證明ROP-2有體外抗氧化功能，故紅外掃描光譜給OPSP具有體外抗氧化性提供支持。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表4 正交試驗(yàn)方差分析

圖5 ROP-2和OPSP的紅外掃描圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)制備ROP的超聲輔助提取與POSP。試驗(yàn)的提取方式與現(xiàn)已報(bào)道的熱水提取工藝相比較，溫度下降31 ℃，提取時(shí)間縮短10 h，得率提高64.15%。因此超聲輔助提取是一個(gè)值得推廣的ROP提取方式。試驗(yàn)還對(duì)ROP功能性組分進(jìn)行分離、鑒定。通過(guò)助干劑篩選試驗(yàn)，確定β-環(huán)糊精作為噴霧干燥的助干劑。通過(guò)正交試驗(yàn)，確定制備黃秋葵多糖噴霧干燥粉的最佳工藝條件。紅外光譜掃描結(jié)果以及體外抗氧化性測(cè)定結(jié)果顯示噴霧干燥的加工方式并未對(duì)ROP的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)造成太大影響。試驗(yàn)結(jié)果為ROP的高效提取和組分鑒定提供理論基礎(chǔ)，也為黃秋葵高值化深加工提供思路和基本試驗(yàn)參數(shù)。