蒸制溫度、時間對滇黃精皂苷元及5-HMF含量的影響

劉品華，劉明研，董建偉，楊芬*

1. 曲靖師范學院化學與環境科學學院（曲靖 655011）；2. 廣西百色農業學校（百色 533000）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl. et Hemsl）為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）植物，是2015版《中華人民共和國藥典》中收載的中藥黃精3個基源品種之一[1]。黃精自古藥食兼用，2002年原國家衛生部（衛法監發[2002]51號）公布為食藥兩用，中國2 000多年的臨床實踐表明其保健和疾病治療功效。

薯蕷皂苷歸屬于甾體皂苷類。甾體皂苷具有降低血糖血脂、防治心腦血管等多種疾病[2]。黃精中的皂苷，以薯蕷皂苷為主[3]，是黃精的特征性和主要活性成分之一[4]。滇黃精總皂苷能有效調和緩解2型糖尿病[5-6]，有明顯的降血糖的功效[7]。

5-羥甲基糠醛（5-HMF）是淡黃褐色固體，有不愉快的氣味，有較高的化學反應活性，其安全風險和保健功效存在爭議。吳毅等[8]、孫瑩等[9]報道，在疾病治療方面有功效，王歌等[10]、譚俊杰等[11]、吳榕等[12]報道，認為存在風險。5-HMF被認為是食品加工內源生成的有害成分。

生品黃精需炮制后入藥或食用，而炮制的重要環節就是蒸制。黃精炮制方法與皂苷含量關系研究有報道，但因炮制方法不同，影響因素較多，加之原料、檢測方法的影響導致結果差異較大。5-HMF在黃精的加熱、存儲或發酵過程都會產生。因此，試驗探究檢測總皂苷元的方法，以及蒸制溫度、時間對滇黃精總皂苷元和5-HMF的影響，為黃精炮制和深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

滇黃精（云南曲靖市煜欣農林生物科技有限公司藥材種植基地）；薯蕷皂苷元（國家藥品標準物質，中國食品藥品檢定研究院）；5-羥甲基糠醛（98%，上海思域化工科技有限公司）；香草醛（AR，天津市光復精細化工研究所）；Methyl Alcohol HPLC/Spectro（美國Tedia天地色譜試劑）；超純水（經0.45 μm微孔濾膜過濾）；香草醛等試劑（均為分析純）。

1260型高壓液相色譜儀（Agilent Technologies Made in Germany）；TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；MS105DU電子天平（Mettler-Toledo GmbH ImLangacher 448606 Greifensee Switzerland）；QL-866漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；LD-4臺式離心機（常州天瑞儀器有限公司）；PS-40超聲波儀（深圳市超藝達科技有限公司）；HH501超級恒溫水?。ǔＶ輫A電器有限公司）；TDL-400離心機（金壇區白塔新寶儀器廠）；LC-ZFG002蒸飯柜（廣東樂創電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蒸制與干燥

1.2.1.1 蒸制時間相同溫度不同制樣方法

鮮滇黃精洗凈后，切片，裝入蒸煮袋中，每袋約500 g，共裝4袋。捆扎袋口，放入蒸飯柜中，分別采用70，80，90和100 ℃進行蒸制，蒸制時間為48 h。取出裝入不銹鋼網框中，放入鼓風干燥箱內，于70℃干燥11 h，取出冷卻，用粉碎機粉碎后過0.250 mm篩，再放入不銹鋼盤中，烘3 h，得不同溫度蒸制48 h的待檢測樣，分別裝袋，放入干燥器備用。

1.2.1.2 蒸制溫度相同時間不同制樣方法

鮮滇黃精洗凈，切片，約2 kg，放入蒸煮袋中，捆扎袋口。放入蒸飯柜中，于90 ℃進行蒸制。蒸制到24，48，72和96 h時分別取出約500 g，裝入不銹鋼網框中，在鼓風干燥箱中，于70 ℃干燥11 h，冷卻后用粉碎機粉碎過60目篩，再放入不銹鋼盤中，烘3 h，得90 ℃蒸制不同時間的待檢測樣，分別裝袋放入干燥器備用。

1.2.1.3 自然干燥樣品制樣方法

鮮滇黃精洗凈，切片，陽光下自然曬干，粉碎后過60目篩，放入鼓風干燥箱70 ℃干燥至恒重，得自然干燥的對照待檢測樣，裝袋放入干燥器備用。

1.2.2 總皂苷的檢測

參考楊圣賢等[13]、苑璐等[14]、尤新軍等[15]的研究，對制備檢測液方法進行修改。同一待檢測樣平行制備檢測液3份。每份檢測液再平行顯色檢測3次。

1.2.2.1 標準品薯蕷皂苷元溶液的制備

準確稱取25 mg薯蕷皂苷元標準品到25 mL容量瓶中，加約10 mL二氯甲烷溶解，再繼續添加到刻度，搖勻，得1.00 mg/mL標準儲備液。置于冰箱冷藏備用（48 h內使用）。

1.2.2.2 檢測液的制備

稱取1～2 g（準確至0.000 1 g，由預試驗確定稱取量，控制檢測結果在標準曲線范圍內）待檢測樣，放入50 mL離心管中。離心管中加入20 mL 80%乙醇，旋渦振蕩1 min，放入240 W超聲儀中60 ℃水浴超聲30 min，取出在4 000 r/min下離心15 min，清液倒入50 mL比色管中。剩余固體再加入15 mL 80%乙醇同法超聲提取，離心后清液合并，同法再提取1次，離心清液合并。將比色管放入80 ℃水浴氮吹至干，加入10.00 mL 2 mol/L硫酸，放入沸水浴中水解60 min，取出冷水浴冷卻后用30%的氫氧化鈉溶液調整pH至6～8。轉入分液漏斗，分別用15，10和10 mL二氯甲烷萃取3次，每次萃取靜置的時間為2～2.5 h。萃取后的二氯甲烷合并到50 mL比色管中，用60 ℃水浴氮吹至干，加入10 mL沸點為60～90 ℃石油醚，于240 W超聲儀中冷水浴超聲1 min，取出靜置至澄清后把石油醚轉入25 mL容量瓶。比色管中的殘留物再用15 mL石油醚分2次同法萃取，同法轉入容量瓶。用石油醚定容后靜置過夜，得待檢測液。同一待檢測樣，制備3份檢測液。

1.2.2.3 顯色方法

取一定量待檢測液到20 mL具塞試管中，于70 ℃水浴氮吹至干。加入0.20 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，搖動溶解固體后，再各加入0.80 mL高氯酸，搖勻。加蓋后放入60 ℃超級恒溫水浴中保溫20 min，取出用冷水浴冷卻至常溫。加入5.00 mL冰乙酸，搖勻，完成顯色（30 min內檢測）。得待用紫外分光光度儀檢測液。

1.2.2.4 檢測波長的確定

取0.10 mL標準品儲備液、2 mL自然干燥樣的待檢測液分別到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測液。設置紫外分光光度儀檢測范圍為450～650 nm，以純水掃基線，用1 cm石英比色皿進行掃描。標準品儲備液、自然干燥樣的待檢測液在540 nm處均有最大吸收，為此確定檢測波長為540 nm。

1.2.2.5 制定標準曲線

分別在6支20 mL具塞試管中移入0，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL標準品儲備液，放熱60 ℃水浴氮吹至干。各試管中分別加入0.20 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測液。以試劑為空白對照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測吸光度。以質量（mg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標作圖，得回歸方程：Y=3.100 0X+0.143 0，R2=0.999。

1.2.2.6 水解時間的考察

精密稱取1 g自然干燥待檢測樣，同1.2.2.2檢測液的制備方法操作，修改水解時間0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h。取2.00 mL石油醚定容液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測液。以試劑為空白對照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測吸光度。由標準曲線回歸方程計算皂苷元的含量。同法平行試驗2次。

1.2.2.7 總皂苷元的檢測

取2.00 mL待檢測液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測液。以試劑為空白對照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測吸光度。由標準曲線回歸方程計算皂苷元的含量。同一待檢測液，同法平行顯色檢測3次。檢測樣中總皂苷元含量按式（1）計算。

1.2.2.8 回收率考察

在0.9～1.2 g范圍稱取自然干燥的待檢測樣（精確至0.000 1 g）至50 mL離心管中。加入2.50 mL 1.00 mg/mL薯蕷皂苷元標準品作為標樣。按1.2.2.2檢測液的制備方法操作。取1.00 mL待檢測液到20 mL具塞試管中，按1.2.2.3的顯色方法制得待用紫外分光光度儀檢測液。以試劑為空白對照，用1 cm石英比色皿，在540 nm處檢測吸光度。由標準曲線回歸方程計算皂苷元含量。同法平行試驗3次。

式中：X為加標樣后檢測的薯蕷皂元質量，mg；Y為稱取自然干燥的待檢測樣質量，g；Z為自然干燥的待檢測樣檢測得到的薯蕷皂苷元含量，%。

1.2.2.9 精密度

精密度數據按照GB/T 6379的規定確定，其重復性和再現性的值是以95%可信度計算。皂苷元的檢測，依據GB/T 6379.6標準中“限的確定”，在重復性條件下所得測試結果可接受性的檢測方法，對重復性限（r），正態分布，95%的概率水平下，臨界極差CR0.95(3)=r=3.3×S（S為標準差），如果重復3次檢測結果的極差（Xmax-Xmin）小于r值，表示測定結果是可以接受的，結果取3次的平均值為最終結果。

1.2.3 5-羥甲基糠醛的檢測

參照GB/T 18932.18—2003，對試樣制備方法適當修改。

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱，Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，甲醇+水（10+90）；流速1.0 mL/min；檢測波長285 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.2.3.2 標準儲備溶液

精密稱取10 mg標準5-羥甲基糠醛，放入50 mL容量瓶，加入5 mL色譜純甲醇，溶解后用超純水定容，配成0.20 mg/mL的標準溶液。

1.2.3.3 繪制標準工作曲線

進樣體積折算為質量0.02，0.10，0.20，0.40，1.00，1.50和2.00 μg，停留時間9 min，回歸方程為Y=7 795.997 3X+25.456 3，R2=1（Y為峰面積；X為5-羥甲基糠醛質量，μg）。

1.2.3.4 試樣的制備

在0.1～0.2 g范圍稱取試樣（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加入約50 mL 10%甲醇，放入240 W超聲儀中常溫水浴超聲20 min，用10%甲醇定容至刻度，混勻。用0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測器測定。

1.2.3.5 平行試驗

對同一試樣進行平行試驗測定。

1.2.3.6 空白試驗

對10%甲醇溶液進行測定。結果按式（3）計算。

式中：X為測定原料中5-羥甲基糠醛含量，mg/kg；m為標準工作曲線得到質量，μg；M為測定稱取原料的質量，g；20為進樣體積，μL；100為定容體積，mL；1 000為換算系數。

1.3 數據分析

采用Excel軟件進行t-檢驗（雙樣本異方差假設分析）。以自然干燥樣品的試驗結果作為對照，考察不同蒸制條件下的差異性。

2 結果與討論

2.1 皂苷

甾體皂苷是由甾體皂苷元與糖、糖醛酸或其它有機酸縮合而成。共存于植物中的酶，能酶解皂苷。黃精的甾體皂苷元以C1或C12位氧化為特征[16]，糖基部分是形成黃精屬植物甾體皂苷分子多樣性的重要因素[17]。目前確定的滇黃精中甾體皂苷類化合物有32個[18]，三萜皂苷類化合物有3個[19-21]。通過品嘗所提取的皂苷，發現會麻口，說明黃精中皂苷是麻口刺喉的成分之一。

薯蕷皂苷元用香草醛、高氯酸顯色30 min內檢測穩定[14]。蒸制導致成分發生變化后，呈色成分會嚴重影響檢測的結果，試驗改進的方法得到的檢測液無色透明，確保檢測結果的可靠性。新鮮的滇黃精直接進行蒸制，可準確考察蒸制條件的影響。

圖1 水解時間考察結果

皂苷由于所鏈糖的不同，用液相色譜儀很難通過標準物質定量檢測。因此，通過水解轉化為較為單一的皂苷元，用分光光度比色法檢測是合理的選擇。由圖1可知，水解1 h后皂苷元含量基本穩定，水解完成，所以確定水解時間為1 h。

由表1可知，3份樣中每份樣顯色3次檢測的極差均小于臨界極差（r），3份的極差也小于臨界極差（r），說明檢測結果是可以接受的。從RSD值也可看出該方法有較好的精密度和良好的重復性。3份樣品檢測平均回收率為97.145%，達到檢測正確度要求。

表1 皂苷元回收率考察結果（n=3）

由表2可知，所有檢測的極差均小于臨界極差（r），RSD值也表明精密度較好，平均值的結果可以接受。與自然干燥相比，70 ℃和80 ℃蒸制均導致皂苷元含量下降，且差異極顯著（p＜0.01）。70 ℃和80 ℃蒸制皂苷元含量均表現出差異極顯著（p＜0.01）。與自然干燥的相比，90 ℃和100 ℃蒸制皂苷元含量沒有差異性（p＞0.05）。原因可能是滇黃精中自身所含的酶，在適當溫度的影響下酶活性提高，導致皂苷的轉化，從而降低皂苷含量。90 ℃以上溫度導致酶失活，從而減少皂苷轉化。皂苷含量的變化與檢測皂苷元含量的變化一致。有研究報道，薯蕷皂苷在炮制過程會轉化為延齡草苷和薯蕷皂苷元[22]，蒸制導致其他成分變化[23]，也可能與酶的作用有關，蒸制滇黃精導致皂苷轉化的成分有待進一步研究。

表2 不同溫度蒸制48 h皂苷元含量檢測結果（n=3）

由表3可知，所有檢測的極差均小于臨界極差（r），RSD值也表明精密度較好，平均值結果可以接受。隨著蒸制時間延長，總皂苷元含量逐漸降低。與自然干燥的皂苷元含量相比較，蒸制72 h以內的下降差異不顯著（p＞0.05），達到96 h皂苷元含量減少差異極顯著（p＜0.01）。變化規律與吳英詳[24]、劉玲等[25]、鐘凌云等[26]研究發現的黃精多次蒸制和炮制后導致總皂苷和皂苷元含量有所降低的結果一致。焦劼等[27]研究報道，云南蒙自、保山的滇黃精中薯蕷皂苷元含量分別2.845和2.355 mg/g，與試驗檢測的皂苷元含量結果相近。

2.2 5-HMF

5-HMF是否對人體造成傷害，取決于不同的暴露途徑、暴露劑量和頻率[28]。適量攝入蛋白質可以消除HMF的危害[29]。

由表4可知，與未蒸制的5-HMF含量相比較，70℃以上蒸制的5-HMF含量增加極顯著（p＜0.01），隨著蒸制溫度升高，5-HMF含量快速增加。從蒸制溫度間差值可以看出，80 ℃以上蒸制5-HMF含量急劇增加。

由表5可知，與未蒸制的5-HMF含量相比較，90℃蒸制24 h增加顯著（p＜0.05），蒸制48 h后增加極顯著（p＜0.01）。從蒸制時間的差值可以看出，48 h后5-HMF含量急劇增加，72 h后5-HMF增加速度有所降低。與楊云等[30]研究清蒸30 h內5-HMF含量基本穩定，30 h以后含量急劇上升的情況一致。5-HMF的化學活性較高，與空氣接觸、受陽光照射均利于進一步反應生產黑精色素。

表3 90 ℃蒸制不同時間皂苷元含量檢測結果（n=3）

表4 不同溫度蒸制48 h 5-HMF的檢測結果（n=3）

3 結論

滇黃精中的皂苷是有效生理活性的主要成分之一，是炮制黃精后希望保留的成分，蒸制導致皂苷轉化的成分有待深入研究。5-HMF在治療疾病方面有作用，但同時也存在安全性風險，其含量是平衡功效與風險的因素。炮制黃精時，建議讓待蒸黃精溫度快速達到90 ℃以上，蒸制時間不應超過48 h，并以24 h以內最佳。由試驗結果推測，40～90 ℃烘干的黃精也會造成皂苷含量下降，應給予重視。