不同干燥方式對松露多糖含量及其抗氧化活性的影響

張存艷，魏藹玲，岳茂林，葉強，郭力，李美鳳

成都中醫藥大學藥學院西南道地藥材協同創新中心中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室（成都 611137）

松露，又稱“塊菌”，是一種子囊菌類大型塊狀真菌[1]，其香味獨特、營養豐富，蛋白質含量普遍比較高，具有保健功能和藥用價值[2]。松露中的多糖類是被研究較多的生物活性物質，多糖的提取率在20%左右，抗氧化活性較好[3-5]，但由于鮮松露含水量高達75.21%～79.39%[6]，在常溫下貯藏易腐爛變質，影響其商品價值，而其干制品不但利于保存，且保留了特殊的香味。干松露包裝后保質期可以延長至1年以上，大大增加了松露的商業價值。目前已有的關于松露的研究報道大多是關于某個營養成分的綜合性研究，但關于不同干燥方式對松露多糖含量及抗氧化活性的影響研究則比較少。故此次試驗考察熱風干燥、微波干燥、冷凍干燥和真空冷凍干燥4種不同的干燥方式對松露多糖含量及其抗氧化活性的影響。篩選出最適合松露的干燥方法，旨在為松露干燥方式提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

電子天平（BSA224S-CW，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱恒溫真空干燥箱（DZF-OB，上海躍進醫療器械有限公司冷凍干燥機）；旋片式真空泵（2XZ-2B，臨海市永昊真空設備有限公司）；微波干燥箱（RWBZ-08S，南京蘇恩瑞干燥設備有限公司）；超聲清洗器（SB-5200DTDN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-6，常州澳華儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZIGF10，上海躍進醫療器械有限公司）；L2S可見光分光光度計（756PC，上海儀電分析儀器有限公司）；旋轉蒸發器（RE 52-99，上海亞榮生化儀器廠）；循環水式真空泵（SHZ-D（Ⅲ），鞏義市予華儀器有限責任公司）；密封型搖擺式粉碎機（HK-10B；上海菲恰爾分析儀器有限公司）；離心機（TDL-6A，上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

新鮮松露，四川省涼山州會東縣農貿市場。

葡萄糖對照品、抗壞血酸對照品，成都曼思特生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2, 2’-聯氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2, 2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS），東京化成工業株式會社；鹽酸、硫酸、苯酚、無水乙醇、過硫酸鉀、氯仿、正丁醇，成都市科龍化工試劑廠，所用試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 干燥工藝

1.3.1.1 鮮松露預處理

取鮮松露，洗去表面泥土，避免其表面出現損傷；待表面水分揮發后，挑選大小相近的松露，切成厚度約為0.5 cm的薄片，分成4份，供下一步處理。

1.3.1.2 真空干燥

使用真空干燥設備，干燥條件：真空度0.2 kPa，干燥溫度50 ℃，以松露含水率13%（濕基）為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.3 熱風干燥

使用電熱鼓風干燥箱設備，干燥條件：干燥溫度50 ℃，干燥風速3 m/s，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.4 真空冷凍干燥

使用真空冷凍干燥設備，干燥條件：溫度-50℃，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

1.3.1.5 微波干燥

使用真空微波干燥設備，干燥條件：干燥溫度50℃，功率400 W，真空度0.2 kPa，以松露含水率13%為干燥終點，記錄干燥時間。

以上干燥完成后，需將松露密封保存于干燥器中，避免吸潮。

1.3.2 多糖提取及純化

1.3.2.1 多糖提取

采用超聲輔助法提取多糖[7-8]。將干燥后的松露粉碎，過40目篩，分別取5.0 g各干燥品粉末，置于250 mL容量瓶，以料液比1∶25（g/mL）加入蒸餾水，超聲處理50 min（140 W，60 ℃），離心10 min（4 500 r/min），取上清，下層沉淀重復以上操作。合并2次上清液，濃縮至50 mL。

1.3.2.2 多糖的純化

脫蛋白：采用Sevag法進行脫蛋白處理[9]。取適量樣品溶液，加入20%體積的Sevag試劑，振蕩后靜置20 min，離心（5 000 r/min，10 min），收集上清液，棄去中間的蛋白層和下層的有機層，重復上述操作直至無沉淀物析出。

醇沉：向脫蛋白的提取液中加入3倍體積的95%乙醇，邊加邊振搖，于4 ℃冰箱靜置過夜；離心15 min（4 500 r/min，4 ℃），收集沉淀。

透析：將上述沉淀溶解于適量體積的蒸餾水，置于分子量截留量為12 000 Da的透析袋中，超純水透析3d，以除去小分子物質。

冷凍干燥：將透析后的溶液離心10 min（4 000 r/min），收集沉淀，于-20 ℃冰箱預凍24 h，轉移至真空冷凍干燥箱，24 h后取出，稱質量，多糖提取率按式（1）計算。

式中：m1為稱量瓶質量，g；m2為稱量瓶及多糖質量，g；m3為松露質量，g。

1.3.3 多糖含量測定

1.3.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[10]。準確稱取10 mg葡萄糖標準品，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即得質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準品溶液。分別吸取0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL葡萄糖標準溶液于具塞試管中，加蒸餾水補至1.0 mL，再加入1.0 mL 5%的苯酚，迅速加入5.0 mL濃硫酸，渦旋混勻后，冷卻至室溫，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標，對應吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=10.05x+0.001 8，R2=0.999 6。

1.3.3.2 多糖含量的測定

稱取25 mg冷凍干燥后的松露多糖，置于25 mL容量瓶，蒸餾水定容。吸取1 mL配制的多糖溶液于具塞試管中，按1.3.3.1小節的方法測定樣品中多糖含量，每組樣品重復測定3次，根據標準曲線計算樣品多糖含量。

1.3.4 多糖抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH·清除率的測定

參照文獻方法[11]。準確稱取15.77 mg DPPH，置于100 mL容量瓶，用無水乙醇溶解并定容，即得0.4 mmol/L的DPPH乙醇溶液（現配現用），保存于棕色試劑瓶中，備用。準確稱取0.1 g松露多糖，用蒸餾水溶解并定容到25 mL，配制不同質量濃度的（0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000，3.000和4.000 mg/mL）的多糖樣品；分別吸取3 mL上述樣品溶液于試管中，加入2 mL DPPH溶液，混勻后，避光靜置反應30 min，在517 nm處測定吸光度A1。同時將3 mL不同濃度的樣品溶液與無水乙醇混勻反應，測定其吸光度A2，測定空白溶劑（3 mL蒸餾水與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液的混合溶液）在517 nm處的吸光度A0，以同等濃度的抗壞血酸溶液為陽性對照。每組做3個平行，結果取均值。DPPH·清除活力按式（2）計算。

1.3.4.2 ABTS+·清除率的測定

參照文獻[12]方法。ABTS儲備液的配制：將5 mL 7 mmol/L ABTS+·溶液和1 mL 15 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下反應12 h，得到ABTS儲備液。取一定量的ABTS儲備液，用蒸餾水稀釋一定倍數后，在734 nm波長處測定吸光度A0（現配現用）。取4 mL ABTS工作液，分別與0.2 mL上述不同質量濃度的松露多糖溶液混合，室溫下反應6 min，在734 nm波長處測定吸光度A1；以同等濃度的抗壞血酸作陽性對照。每組做3個平行，結果取均值。ABTS+·清除率按式（3）計算。

1.4 數據處理與統計分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據方差分析，結果以平均值±標準差表示，并用Duncan’s法進行多重比較，Pearson’s法進行相關性分析。以p＜0.05表示差異或相關性顯著，以p＜0.01表示差異或相關性極顯著。

2 結果與分析

2.1 干燥方式對松露多糖含量的影響

2.1.1 多糖提取率

4種干燥方式對松露多糖提取率的影響及以含水率低于13%為干燥終點時所用的時間結果如表1所示。真空冷凍干燥后松露多糖提取率為7.56%±0.37%，顯著高于微波干燥（6.60%±0.43%）、熱風干燥（6.30%±0.17%）、真空干燥（5.12%±0.26%）（p＜0.05）；熱風干燥與微波干燥對松露多糖提取率無顯著性影響（p＞0.05）；真空干燥松露多糖的提取率最低，說明不同干燥方式會造成松露多糖不同程度的損失。不同干燥方式所需的干燥時間為真空干燥（10 h）＞熱風干燥（8 h）＞微波干燥（7 h）＞真空冷凍干燥（4 h），多糖提取率與干燥時間存在著負相關性（p＜0.05），即干燥時間越長，松露多糖的提取率越低，說明隨著干燥時間的延長，松露多糖降解得越多。

表1 干燥方式對松露多糖提取率、干燥時間及多糖含量的影響

2.1.2 多糖含量

如表1 所示，經不同方式干燥處理，松露多糖含量由高到低依次為真空冷凍干燥（34.40%±0.26%）、熱風干燥（31.40%±0.26%）、真空干燥（28.50%±0.53%）、微波干燥（28.30%±0.57%），真空冷凍干燥后松露多糖含量明顯高于熱風干燥、真空干燥、微波干燥（p＞0.05），真空干燥和微波干燥對松露多糖含量無顯著影響（p＞0.05），說明真空冷凍干燥對松露多糖的含量影響最小。

2.2 干燥方式對松露多糖抗氧化活性的影響

2.2.1 松露多糖對DPPH·的清除能力

由圖1可知，經4種干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·均有較好的清除效果，且效果隨著其質量濃度的增加而逐漸增強，但均比對照品VC的作用弱。當多糖質量濃度為4 mg/mL時，真空冷凍干燥所得松露多糖提取物對DPPH·清除活力達到了65.18%，作用明顯強于微波干燥、熱風干燥、真空干燥的松露多糖提取物（p＜0.05）。松露多糖提取物對DPPH·的清除率可用DPPH·清除率達到50%時多糖的質量濃度即IC50來表示，IC50值越小說明該多糖清除DPPH·的能力越強。經真空冷凍干燥、微波干燥、熱風干燥、真空干燥，松露多糖提取物的DPPH·清除率IC50值分別是1.816，2.554，3.959和2.860 mg/mL，即松露多糖提取物對DPPH·的清除率為真空冷凍干燥＞微波干燥＞真空干燥＞熱風干燥。結果表明松露經真空冷凍干燥處理，可以更好地保留松露多糖的抗氧化活性。

圖1 4種干燥方式對DPPH·清除活力的影響

2.2.2 松露多糖對ABTS+·的清除能力

由圖2可知，4種干燥方式處理的松露多糖對ABTS+·均有較強的清除作用，且隨著樣品質量濃度的增加而增強，但均比對照品VC的作用弱當質量濃度為1.25 mg/mL時，其對ABTS+·清除活力由高到低分別為真空冷凍干燥（65.7%）＞微波干燥（53.09%）＞真空干燥（51.78%）＞熱風干燥（44.78%）；其對ABTS+·清除率IC50值由小到大為真空冷凍干燥（0.91）＜微波干燥（1.062）＜真空干燥（1.138）＜熱風干燥（1.246），說明真空冷凍干燥松露多糖提取物對ABTS+·的清除活力最強，熱風干燥作用最弱。

綜上，不同干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·清除活力趨勢一致。當質量濃度為1.00 mg/mL時，松露多糖提取物對DPPH·的清除能力大小為真空冷凍干燥（40.22%）＞微波干燥（37.59%）＞真空干燥（37.48%）＞熱風干燥（28.28%）；其對ABTS+·的清除能力大小為真空冷凍干燥（54.03%）＞微波干燥（47.88%）＞真空干燥（40.52%）＞熱風干燥（36.86%），說明松露多糖提取物對ABTS+·的清除效果優于相同質量濃度下對DPPH·的清除效果。

3 討論與結論

3.1 討論

結果顯示，真空冷凍干燥松露多糖提取率最高，這與真空冷凍干燥技術的特點有關[13]，其特點為低溫脫水，使松露本身的物理、化學和生物狀態基本不變，從而使松露本身的營養物質和有效成分得到最大保留。而微波干燥、熱風干燥、真空干燥都是通過高溫加熱來達到干燥的目的，雖然都具有干燥速度快、效率高等特點[14]，但是在干燥過程中其對具有揮發性成分和熱敏性物質具有較大的破壞作用，從而使多糖含量不同程度的降低。

松露中的多糖類是研究較多的生物活性物質，松露多糖普遍具有顯著的抗氧化活性[15]，多糖純化程度越高，抗氧化能力越強。在對國產松露的子實體提取物進行抗氧化研究時，發現松露的乙醇提取物有很高的DPPH·清除活性，乙酸乙酯提取物對羥自由基及鐵離子表現出較強的清除能力或螯合能力，但是石油醚提取物的清除自由基和鐵離子鰲合能力較差[16]，說明松露中能清除自由基的活性物質是極性較大的組分，主要提取到極性大的乙酸乙酯和乙醇中，而非極性的石油醚中含量較少。同時，多糖易溶于水，因此此次試驗以大極性的水為提取溶劑，以超聲法提取松露多糖，并對不同干燥方式處理的多糖提取物的抗氧化活性進行了評價。

3.2 結論

經不同干燥方式處理的松露多糖提取率與干燥時間具有相關性，即干燥時間越長，松露多糖的提取率越低；不同干燥方式對松露多糖含量的影響為真空冷凍干燥＞熱風干燥＞真空干燥＞微波干燥。4種干燥方式處理的松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·均具有較好的清除能力，且對ABTS+·的清除效果優于相同質量濃度下對DPPH·的清除效果。真空冷凍干燥后松露多糖提取物對DPPH·、ABTS+·的清除作用最強，熱風干燥作用最弱。

綜上所述，真空冷凍干燥對松露多糖保留率最高、耗時最少、抗氧化活性最強，是新鮮松露干燥的最佳方式。