蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

方建軍，張旭*，黃華*，王健，郭浩煒，毛小紅

1. 衢州市食品藥品檢驗研究院（衢州 324000）；2. 浙江江山健康蜂業(yè)有限公司（江山 324100）

蜂王漿又名王漿、蜂皇漿、皇漿、蜂乳，是由適齡工蜂的舌腺和上顎腺所分泌的物質(zhì)，顏色為白色或淡黃色，味道酸且略帶辛辣、澀，被用作蜂王和蜜蜂幼蟲的主要食物[1-3]。蜂王漿富含氨基酸、糖類、有機(jī)酸等多種活性成分[4]，是集營養(yǎng)、食療及保健多位一體的天然物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及護(hù)膚美容等其他多方面生理作用，被譽(yù)為“生命青春之源”[5]。中國是蜂王漿生產(chǎn)和出口第一大國，世界上90%以上的蜂王漿產(chǎn)自中國[6]，主要出口日本、歐盟和美國等發(fā)達(dá)國家和經(jīng)濟(jì)體[7]。隨著對蜂王漿的研究日益深入，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。

農(nóng)藥在防治農(nóng)作物、蔬菜、水果及除雜草等方面發(fā)揮重要作用，而蜜蜂通過采集花蜜過程間接將農(nóng)藥帶入產(chǎn)出的蜂王漿中，影響蜂王漿的食用安全[8-9]。

隨著蜂王漿營養(yǎng)價值認(rèn)可度的不斷提高，人們對其消費需求不斷增長，對其品質(zhì)要求也越來越高，農(nóng)藥殘留成為衡量蜂王漿產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)。’

1 蜂王漿農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀

國內(nèi)外的蜂王漿農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀并不樂觀，有機(jī)磷、有機(jī)氯、除草劑、殺螨劑、新煙堿類等農(nóng)藥的廣泛使用，給蜂王漿產(chǎn)品的品質(zhì)安全帶來極大隱患[10-13]。自2001年以來，以蜂蜜和蜂王漿為代表的蜂產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留問題受到關(guān)注，農(nóng)殘限度升級為出口蜂產(chǎn)品的常規(guī)品質(zhì)要求，也成為蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易的綠色壁壘[14]。2019年，日本、歐盟對蜂王漿農(nóng)藥殘留限量要求提高，中國需要研究突破日本、歐盟技術(shù)壁壘的農(nóng)藥殘留檢測的法定標(biāo)準(zhǔn)，從而解決農(nóng)藥殘留問題。以日本客戶需求為例，進(jìn)口的蜂王漿需要檢測多菌靈、克螨特、苯菌靈、蠅毒磷、氟胺氰菊酯、三唑醇、毒死蜱、吡氟氯禾靈、甲基硫菌靈、乙基硫菌靈、草甘膦、雙甲脒、雙甲脒代謝物2, 4-DMA、雙甲脒代謝物DMF、雙甲脒代謝物DMPF、雙甲脒代謝物總殘留量、氯苯胺靈等17種高風(fēng)險農(nóng)藥殘留。為保證國內(nèi)消費市場和進(jìn)出口市場蜂王漿產(chǎn)品的品質(zhì)，針對中國蜂王漿農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)及檢測現(xiàn)狀和進(jìn)出口格局，加強(qiáng)對蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究和開發(fā)刻不容緩。

2 蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法

蜂王漿基質(zhì)復(fù)雜、黏度大，在提取的時候雜質(zhì)多，易乳化，因此在對其進(jìn)行前處理的過程中，若提取試劑和方法不當(dāng)，則不利于目標(biāo)物的提取和分離。在國內(nèi)外學(xué)者對蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測報道中，固相萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理。固相萃取技術(shù)利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的，具有操作簡單、除雜效果好、待測組分回收率高等優(yōu)點。

夏廣輝等[15]將蜂王漿樣品用乙腈-水（體積比1∶1）溶解提取，提取液用C18柱凈化，殺蟲劑的平均加標(biāo)回收率在79.7%～82.5%。侯建波等[7]將蜂王漿樣品用氨水-乙腈（體積比5∶95）渦旋混勻，提取液經(jīng)過中性Al2O3固相萃取柱凈化，雙甲脒及其代謝物的平均加標(biāo)回收率在80%～110%。Gerardo等[16]將蜂王漿樣品經(jīng)過超純水初步溶解后，用1%乙腈-乙酸（V/V）振蕩提取后離心取上清液，用%乙腈-甲酸（V/V）振蕩提取后離心取上清液，提取液經(jīng)過C18、硅藻土和氧化鋅填充柱凈化后檢測，殺菌劑的平均回收率在70%～120%。李櫻紅等[14]將蜂王漿樣品經(jīng)過氨水溶解后，加入乙腈-水（體積比1∶1）渦旋振蕩提取，離心后上清液用HLB固相萃取小柱凈化后檢測，氟胺氰菊酯等7種高風(fēng)險農(nóng)藥的平均回收率是81%～101%。周萍等[17]在堿性條件下用乙腈萃取，經(jīng)HLB柱凈化后檢測蜂王漿中的三唑醇、蠅毒磷和氟胺氰菊酯，平均回收率在78.9%～102.1%。GB 23200.101—2016[18]中將蜂王漿樣品先用水溶解后，加入正己烷-丙酮（1∶1）渦旋振蕩提取，離心后上清液濃縮經(jīng)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后檢測，殺螨劑的平均回收率在71%～115%。

3 蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測方法

對于蜂王漿中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析，由于復(fù)雜的混合物中的待測組分一般是mg/kg等級，屬于痕量分析[19]，為測得樣品中農(nóng)藥的準(zhǔn)確含量，使測定方法的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到相關(guān)規(guī)定，必須采用高靈敏度的痕量分析技術(shù)。針對蜂王漿中農(nóng)藥殘留的測定方法，主要有氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和氣質(zhì)聯(lián)用法[20]。

3.1 高效氣相色譜法

氣相色譜法具有操作簡單、分析速度快、選擇性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是分析有機(jī)化合物必不可少的一種手段，在化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等各大領(lǐng)域均有應(yīng)用[21]。Emmanouel等[11]將樣品經(jīng)過乙腈等溶劑振蕩提取和C18固相萃取技術(shù)凈化處理，利用氣相色譜法檢測蜂王漿中的有機(jī)氯和有機(jī)磷。譚韓英等[12]將樣品經(jīng)過乙腈、正己烷等有機(jī)溶劑溶解提取和Florisil固相萃取技術(shù)凈化處理，利用氣相色譜法測定蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量。GB 23200.100—2016[22]中將蜂王漿樣品用水溶解，加正己烷、丙酮、乙醚等溶劑處理后，經(jīng)過弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，氣相色譜檢測菊酯類農(nóng)藥。王祥云等[23]將蜂王漿樣品用水溶解，再加正己烷、丙酮、乙醚等溶劑處理后，經(jīng)過弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，氣相色譜檢測氟胺氰菊酯農(nóng)藥。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法對于分析沸點高不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性不強(qiáng)和相對分子質(zhì)量大的有機(jī)化合物，可以較準(zhǔn)確地定性和定量。國內(nèi)外關(guān)于高效液相色譜法檢測蜂王漿中農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)資料不多，董盛月[24]用正己烷、二氯甲烷等溶劑提取后，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化處理，用超高效液相色譜梯度洗脫與紫外檢測器檢測蜂王漿中的氟氯苯氰菊酯與氟胺氰菊酯殘留。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜法

GC-MS技術(shù)是利用氣相色譜的高分離性結(jié)合質(zhì)譜能辨別出待測物的結(jié)構(gòu)，以達(dá)到待測物的定性定量檢測。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，是樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。Gerardo等[25]將樣品用水溶解后，使用正己烷和乙酸乙酯提取，經(jīng)C18固相萃取柱凈化后GC-MS檢測蜂王漿中的多種農(nóng)藥殘留。周召千等[26]將樣品溶解后沉淀蛋白，在堿性條件下用正己烷、丙酮提取，用GC-MS檢測蜂王漿中的雙甲脒殘留量。GB 23200.103—2016[27]方法將樣品用鹽酸溶液溶解，用正己烷、乙醚、丙酮等溶劑提取凈化，得到的樣液用GC-MS檢測蜂王漿中的雙甲脒及其代謝物殘留量。GB 23200.103—2016[28]方法將樣品用水溶解，用正己烷、乙醚、丙酮等溶劑提取，經(jīng)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，得到的樣液用GC-MS檢測蜂王漿中多種殺螨劑殘留量。

3.4 液相色譜-質(zhì)譜法

LC-MS/MS技術(shù)利用液相色譜分離待測物與干擾物，通過質(zhì)譜對待測物進(jìn)行檢測分析。該技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點，被越來越廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域。侯建波等[29]將樣品用水溶解后，加入甲醇沉淀蛋白并提取，以PSA、C18和無水MgSO4為分散劑進(jìn)行QuEChERS凈化，采用LC-MS/MS檢測蜂王漿中多種新型煙堿類藥物及其代謝物殘留量。Giroud等[10]將蜂王漿樣品用水溶解后，加乙腈、醋酸鹽緩沖液提取后經(jīng)-18 ℃冷凍存放15 h，離心分層取上清液，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥后加H2O/MeOH（80/20，V/V）復(fù)溶上LC-MS/MS檢測多種新型煙堿類藥物及其代謝物殘留量。GB 23200.99—2016[30]將樣品加水溶解后，經(jīng)乙腈、氯化鈉、丙酮和乙醚處理后，用中性氧化鋁固相萃取柱凈化上LC-MS/MS檢測8種氨基甲酸類農(nóng)藥殘留。

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，飲食的安全與健康越來越受到重視，對于保健品的需求也不斷增加。蜂王漿是上等的具有多種保健功能的理想食品，因此需要有先進(jìn)的檢測技術(shù)，保障其品質(zhì)安全。國內(nèi)外關(guān)于蜂王漿的研究不斷增多，相關(guān)農(nóng)藥殘留的檢測也不少，但是方法涉及的農(nóng)殘品種偏少，類別單一，前處理過程和檢測手段不同且繁瑣，顯著增加企業(yè)日常品質(zhì)控制成本。同時隨著國際標(biāo)準(zhǔn)提高，現(xiàn)有的法定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)不到檢測要求，以草甘膦為例，國內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)報道，無法滿足蜂王漿出口企業(yè)的實際需求。

針對中國蜂王漿農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)及檢測現(xiàn)狀和出口格局，以破解日本（我國蜂王漿最大出口國）技術(shù)壁壘為突破口，建立規(guī)范統(tǒng)一有效的多種高風(fēng)險農(nóng)藥殘留量的檢測方法。方法的建立可供國內(nèi)乃至國外企業(yè)、檢測機(jī)構(gòu)使用，避免重復(fù)建設(shè)，同時可以滿足日本客戶的需求，解決中國大部分蜂產(chǎn)品的技術(shù)壁壘問題，因此研究科學(xué)合理的蜂王漿中農(nóng)藥多殘留檢測方法具有迫切而深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。