PRiME凈化-UHPLC-MS/MS法測定雞蛋中金剛烷胺類藥物殘留

李占彬，王正強，黃永橋，楊鴻波

貴州省分析測試研究院（貴陽 550014）

金剛烷胺類藥物具有飽和三環癸烷的結構，主要有金剛烷胺（Amantadine）、金剛乙胺（Rimantadine）、美金剛（Memantine）等（圖1），具有抗流感病毒、抗帕金森氏綜合征等藥理作用[1-4]。在家禽養殖過程中，金剛烷胺類藥物被廣泛用于雞禽流感的預防和早期治療。隨著養殖規模的擴大及流感類疾病的頻發，金剛烷胺類藥物使用劑量正在日益增加，食用這種有金剛烷胺類藥物殘留的禽產品，會導致人體對病毒的耐藥性增加[5-7]。農業部在2005年發布的農業部第560號公告中明確禁止金剛烷胺類抗病毒藥物生產、銷售及使用，但在實際養殖過程中，仍存在非法使用該類藥物，這已成為我國畜禽產品安全的重要影響因素，因此亟需建立一種快速檢測該類藥物殘留的檢測方法。

目前已報道的金剛烷胺類藥物檢測的方法主要有高效液相色譜法[8-10]、高效液相色譜-串聯質譜法[11-14]、氣相色譜法[15-17]，這些方法測定的基質各異。其中，湯曉艷等[5]建立的雞蛋中金剛烷胺殘留測定方法中，樣品處理過程繁瑣、耗時長、使用大量有試劑，且方法檢出限較大，難以滿足快速分析的需要；林濤等[19]和吳銀良等[18]建立的雞蛋中金剛烷胺類藥物殘留量的測定方法，樣品前處理使用QuCHERS試劑進行凈化，該方法雖然簡單快速，但其去除干擾物質的能力較SPE柱略差，對結果的準確性有一定影響。

此次試驗的樣品前處理使用PRiME HLB進行凈化，前處理簡單，并且基質干擾較小、靈敏度較高，能得到較為滿意的效果。通過優化UHPLC-MS/MS條件，并對雞蛋樣品進行測定，建立了同時測定3種金剛烷胺類藥物的快速檢驗方法，并采用同位素內標法進行定量分析。該方法具有操作簡單、快速、定性定量準確等優點，適用于雞蛋中金剛烷胺類藥物的測定，為金剛烷胺類藥物的檢測提供更多的技術選擇。

圖1 3種物質的化學結構式

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 主要儀器與設備

Agilent 1290超高效液相色譜儀、Agilent 6470 QQQ三重串聯四極桿質譜，配有ESI源（美國Agilent公司）；Blixer3攪拌機（法國ROBOT COUPA公司）；LT2002電子天平（常熟市天量儀器有限公司）；UMV-2多管渦旋混合器（北京普立泰科儀器有限公司）；離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；Supelco 12管固相萃取裝置（美國Supelco公司）；氮吹儀（上海安普實驗科技股份有限公司）；陶瓷均質子（迪馬科技有限公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（美國Waters公司）；0.22 μm PTFE濾膜（上海安普實驗科技股份有限公司）。

1.1.2 主要材料與試劑

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、金剛烷胺-D6、美金剛-D6（純度＞98%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安普實驗科技股份有限公司）；乙酸銨（分析純、西亞試劑）。

1.2 標準溶液配制

分別精密稱取10 mg（精確至0.000 1 g）金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標準品于100.0 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混勻，配制成質量濃度為100 mg/L標準儲備液，于-18 ℃避光保存。分別從金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛標準儲備液中移取100.0 μL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合標準中間液；移取100.0 μL混合標準中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 μg/L的混合標準工作液；備用。分別從金剛烷胺-D6、美金剛-D6標準儲備液中移取100.0 μL標準儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 mg/L的混合內標中間液；移取500.0 μL混合標準中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成50 μg/L的混合內標工作液；備用。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18反向色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度

1.4 質譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應監測（MRM）；毛細管電壓，4.5 kV；霧化器壓力，40 psi；干燥氣流速，10 L/min；干燥氣溫度，300 ℃；鞘氣流速，10 L/min；鞘氣溫度，300 ℃。其他質譜條件見表2。

表2 質譜條件

1.5 樣品前處理

稱取5.00 g混勻后的樣品于50 mL具塞離心管中，加入0.10 mL混合內標工作液，準確加入20 mL 0.2%甲酸乙腈，加蓋后渦旋振蕩10 min，以4 500 r/min常溫離心10 min，吸取約3 mL上清液過PRiME HLB固相萃取柱（無需對小柱進行活化、淋洗等步驟），以1滴/s的速度過柱，棄去前幾滴流出液，收集剩余續濾液，準確量取2.0 mL濾液于另一個15 mL離心管中，在45 ℃在氮吹至近干，用1 mL初始流動相溶解殘渣，渦旋混勻，過0.22 μm PTFE濾膜，供UHPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

根據金剛烷胺類藥物化學結構的特點，其容易得到H+而形成[M+H]+準分子離子，故試驗選擇正離子模式監測，在正離子模式下一級全掃描質譜，得到相應的分子離子峰（[M+H]+）；通過優化錐孔電壓，對母離子進行二級質譜分析，得到子離子特征碎片質譜圖；選擇特征碎片中離子中響應值高、基線噪聲低的2對離子對作為定性、定量離子對，優化子離子對碰撞能量，使其豐度最大；進一步優化毛細管電壓、霧化器壓力、干燥和鞘氣的溫度及壓力等質譜參數，經優化后得到表2的質譜參數。

2.2 色譜條件的選擇

試驗采用反相C18色譜柱對金剛烷胺類藥物進行分離。分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水含2 mmol/L乙酸銨溶液等不同洗脫體系對目標物分離能力。結果表明，使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，目標物有良好的色譜分離效果，色譜峰峰型更好，且有較好的響應值。金剛乙胺和美金剛屬同分異構體，同時它們的碎片離子完全相同，等度洗脫很難將其進行分離，故采用梯度洗脫的方式進行分離，通過優化流動相流速、組成和比例、柱溫等色譜條件，結果見圖2，經優化后得到表1的色譜條件。

圖2 金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛標準溶液的TIC色譜圖

2.3 樣品前處理的優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

雞蛋樣品中富含蛋白質和脂肪等物質，因此在樣品前處理時需要考慮沉淀蛋白和去除脂肪。乙腈具有沉淀蛋白的效果，常作為提取劑。試驗分別考察了乙腈、80%乙腈、0.2%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）的提取效率。由圖3可知，選取0.1%甲酸乙腈和80%乙腈（含0.2%甲酸）作為提取劑時，金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛的回收率大于90%，略高于乙腈、80%乙腈水的回收率，考慮到沉淀蛋白的效果和氮吹濃縮的時間，選用80%乙腈（含0.2%甲酸）作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑的回收率

2.3.2 凈化柱的選擇

試驗采用PRiME HLB固相萃取小柱進行樣品的凈化。考察了混合型陽離子交換柱MCX及PRiME HLB固相萃取柱的保留效果，結果發現，采用MCX固相萃取柱能減少樣品中雜質，且目標物損失較少，回收率在90%左右，但是使用MCX小柱凈化操作步驟繁瑣，耗時較長，且過程中使用大量有機試劑，對人體健康影響較大。采用PRiME HLB，酸化乙腈的提取液直接過柱，固相萃取小柱無需活化，目標物化合物通過小柱，樣品中磷脂、脂肪等雜質被吸附于萃取柱，這樣既能使干擾物有效去除，又確保待測組分損失較小，同時在凈化過程中省去了溶劑轉換的過程，簡化了操作步驟，且目標物的回收率在90%左右，與MCX固相萃取柱回收率相當，故采用PRiME HLB固相萃取小柱進行凈化。

2.4 樣品的基質效應

使用ESI源質譜儀分析食品中獸藥殘留時，基質效應是時常遇到的現象，儀器的靈敏度和重現性易受基質效應的影響，同位素內標法因其性質與目標物相似，受基質影響程度相同，是液質聯用分析中常采用的降低基質效應、提高定量準確性的一種方法[20]。試驗選用金剛烷胺-D6和美金剛-D6作為內標物進行校正，金剛烷胺-D6作為金剛烷胺同位素內標物，美金剛-D6作為美金剛和金剛乙胺同位素內標物。由于樣品溶液有已知濃度的同位素內標物，故減少了樣品基質效應的影響，確保了方法的靈敏度、重現性和定量分析準確性。

2.5 標準曲線與最低檢出限

在試驗所確定的色譜和質譜條件下，分別配制3種藥物質量濃度為0.025，0.05，0.10，0.20，0.50，1.25，2.50和5.00 μg/L的系列混合標準溶液（內標物質量濃度為0.50 μg/L）。以待測物標準溶液質量濃度為橫坐標，以標準品定量離子對與內標物離子對峰面積的比值為縱坐標，分別繪制3種金剛烷胺類藥物標準溶液工作曲線。結果表明，金剛烷胺類藥物在0.025～5.00 μg/L的質量濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數（R2）在0.999 2以上，適用于定量分析。通過向陰性樣品中添加目標物來考察方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），結果見表3。說明該方法具有較好的靈敏度。

表3 線性范圍、線性方程、相關系數（R2）、檢出限和定量限

2.6 精密度及加標回收試驗

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法進行加標回收試驗，選取雞蛋陰性樣品，分別添加0.05，0.1和0.5 μg/kg 3個不同濃度，每個添加水平做6個平行，按照1.5小節方法進行提取凈化，3個加標濃度連續做3 d，以考察方法的準確度和精密度，準確度以相對偏差表示，精密度以變異系數（C.V.）表示，計算加標回收率、日內變異系數和日間變異系數。標準溶液、空白樣品和加標樣品的MRM色譜圖見圖4～圖6，結果如表4所示。目標分析物的準確度均小于15%，日內平均回收率為分別為：金剛烷胺，92.6%～102.0%；金剛乙胺，103.4%～109.5%；美金剛，91.6%～96.6%。日內變異系數分別為：金剛烷胺，4.7%～9.8%；金剛乙胺，2.8%～3.0%；美金剛，1.7%～5.2%。日間平均回收率分別為：金剛烷胺，89.9%～99.1%；金剛乙胺，97.9%～105.5%；美金剛，97.4%～98.8%。日間變異系數分別為：金剛烷胺，2.7%～3.0%；金剛乙胺，3.4%～5.1%；美金剛，3.1%～6.8%。說明該方法具有良好的重復性與穩定性，能夠滿足雞蛋樣品中金剛烷胺類藥物殘留分析檢測的要求。

表4 加標回收率和精密度

圖4 金剛烷胺類藥物標準溶液（0.25 μg/L）MRM色譜圖

圖5 雞蛋空白樣品MRM色譜圖

圖6 雞蛋空白樣品加標（0.5 μg/kg）MRM色譜圖

2.7 方法的應用

選取100批次市售的雞蛋樣品，按此次試驗建立的方法進行測定。其中，3個樣品檢測出金剛烷胺，含量分別為0.925，1.69和28.8 μg/kg，其他兩種藥物均未檢出。

3 討論與結論

此次試驗建立了同時測定雞蛋中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留量的同位素稀釋超高效液相色譜-串聯質譜法的快速檢測方法。以0.1%甲酸乙腈水溶液作為提取劑，用PRiME HLB固相萃取柱凈化。結果表明，金剛烷胺類藥物在6 min內完成分析，相關系數在0.999 2以上，檢出限為0.5 μg/kg，在0.5，1和2 μg/kg 3個添加水平下的準確度均小于15%，3種藥物平均回收率在89.9%～109.5%之間，日內（n=6）變異系數在1.7%～9.8%之間，日間（n=3）變異系數在2.7%～6.8%之間。該方法操作簡單、回收率高、重現性好，具有良好的準確度和精密度，能夠準確定性和定量分析金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛，為雞蛋中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留量的檢測提供技術支撐，為監管部門及食品安全提供更多的理論依據。