母乳中脂溶性維生素的HPLC法建立及前處理方法

劉慧敏，聶琴，黃召，楊夢竹，吳夢迪，曹曉琴

江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院（武漢 430056）

脂溶性維生素是機(jī)體生命活動所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，但這些營養(yǎng)素儲存在肝臟和脂肪組織中并且消除較慢，過量攝入FSV可能會對人體造成危害[3-4]。而母乳作為嬰兒的主要營養(yǎng)供給，其維生素的含量對母乳的成分組成十分關(guān)鍵[5-7]。母乳中的脂溶性維生素的測量對于保證母乳品質(zhì)非常重要。

文獻(xiàn)通常采用高效液相色譜（HPLC）法[8-11]或熒光檢測分析[12]或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[13]分析食品中的脂溶性維生素?？紤]到維生素在母乳中的含量一般在毫克與微克之間，所以試驗(yàn)采用簡單快速的HPLC進(jìn)行檢測。然而由于母乳基質(zhì)的復(fù)雜性，不同穩(wěn)定性使脂溶性維生素的提取過程至關(guān)重要，母乳中脂溶性維生素常被包被在脂肪或脂溶性雜質(zhì)中，對脂溶性維生素的測定造成極大干擾[14-16]，此外，如果應(yīng)用的提取方案無法有效去除脂質(zhì)，高脂肪含量會影響色譜效率，縮短色譜柱壽命，降低分析物回收率。因此，對母乳中的脂溶性維生素前處理方法進(jìn)行探究具有重要意義。文獻(xiàn)中最常用的方法為熱皂化法[17]。然而由于脂溶性維生素的不穩(wěn)定性，容易受到光、氧、熱和酸堿因素的影響，熱皂化法容易導(dǎo)致維生素D及類胡蘿卜素的異構(gòu)化以及維生素K4和葉黃素的降解[6]。隨著技術(shù)的不斷革新，對于基質(zhì)中的脂溶性維生素的提取有了更多選擇。低溫酶解皂化技術(shù)、液液萃取、固相萃取和超臨界流體萃取技術(shù)使得脂溶性維生素的提取效率明顯提高[18]。但母乳中的脂溶性維生素必須采用破壁技術(shù)釋放，常規(guī)的皂化法、酶解法和有機(jī)溶劑法等，其破壁的程度和穩(wěn)定性不同，對回收率的影響很大。試驗(yàn)建立薄層層析（TLC）分離法前處理母乳中的脂溶性維生素，通過各種前處理方法比較，為測定脂溶性維生素時(shí)前處理方法的選擇提出建議，為母乳中的脂溶性維生素的測定提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳（健康產(chǎn)婦親友捐贈）；蒙牛全脂甜奶粉（市售）；維生素A醋酸酯、維生素E對照品（純度均≥96%，上海源葉生物科技有限公司）；木瓜蛋白酶（賽國生物科技有限責(zé)任公司，批號P-3250，活性0.5～2 U/mg）；維生素C（批號20180301，華中藥業(yè)股份有限公司）；G型薄層硅膠板（批號20190205，青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1220高效液相色譜儀配紫外檢測器和LC solution色譜工作站；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；TD6A低速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Wonda Sil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相，甲醇；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長300 nm；運(yùn)行時(shí)間10 min。

1.3.2 對照品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)對照品貯備液的配制。精密稱取10.0 mg維生素A醋酸酯、維生素E對照品，用1 mL甲醇溶解、定容，分別制成質(zhì)量濃度10.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃避光保存。

混合對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1 mL，加入空白樣品提取液中，定容到10 mL，制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光保存。

1.3.3 供試品的制備

母乳樣品：分別于早、中、晚各取3位健康產(chǎn)婦的乳汁各10 mL，每位產(chǎn)婦的早、中、晚乳汁混勻作為供試母乳樣品。

奶粉樣品：隨機(jī)取20 g同一批號的供試品，混勻作為試樣。采用建立的檢測方法進(jìn)行空白基質(zhì)的篩選，測定結(jié)果為無任何干擾峰的基質(zhì)作為空白基質(zhì)，用于樣品添加試驗(yàn)。

1.3.4 前處理?xiàng)l件

取10 cm×20 cm，厚度0.25 mm硅膠G板于110 ℃活化30 min備用。

準(zhǔn)確稱取2.00 mL母乳（精確至0.01 g）至50 mL塑料離心管中，加入10 mL無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)；加入10 mL正己烷，超聲提取15 min，加入2 mL飽和氯化鈉溶液抑制乳化，混勻后以4 000 r/min離心10 min分層，取正己烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，加入1 mL二氯甲烷，振蕩溶解殘?jiān)?/p>

準(zhǔn)確稱取2.00 mg奶粉樣品（精確至0.01 g）至50 mL塑料離心管中，加入20 μL一定濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入2 mL 50 ℃溫水使奶粉溶解，加入10 mL無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)；后面步驟同1.3.5母乳操作步驟。

點(diǎn)樣。取溶液全部點(diǎn)于10 cm×20 cm硅膠板上，同時(shí)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

層析。用100%二氯甲烷展開劑層析，上行9 cm處取出，晾干。

顯色。使用95%乙醇-濃硫酸（1∶1，V/V）作為顯色劑，均勻噴于板面，置于105 ℃恒溫烘箱中烘10 min后取出。

收集。用刮刀刮下樣品點(diǎn)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)混合液的顯色區(qū)，用1 mL甲醇振蕩溶解，取上清液通過0.22 μm濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 TLC分離法的優(yōu)化

2.1.1.1 溶劑的選擇

綜合文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道，分別以石油醚、正己烷、二氯甲烷為提取溶劑，以100%氯仿為展開劑，分別考察提取劑效果。結(jié)果表明，采用石油醚、正己烷、二氯甲烷分別作為提取溶劑時(shí)維生素A和維生素E的平均回收率分別為71.4%和67.1%，94.5%和92.1%，65.8%和57.1%，RSD分別為0.35%和0.41%，0.12%和0.17%，0.32%和0.27%。由此可知，采用正己烷作為提取溶劑時(shí)待測物提取回收率最高且穩(wěn)定性最好，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

2.1.1.2 展開劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，分別以環(huán)己烷-石油醚（8∶2，V/V）、100%二氯甲烷、100%氯仿為展開劑，以正己烷為提取溶劑，計(jì)算不同展開劑條件下的Rf值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以100%二氯甲烷為展開劑時(shí)，能在0.5 h內(nèi)使得維生素A與維生素E完全分離，并且能夠得到較好分離比，根據(jù)100%二氯甲烷展開時(shí)的Rf1=0.36，Rf2=0.92，以上述操作點(diǎn)樣層析上行9 cm，展開時(shí)間15 min（見圖1），維生素E上行至3.2 cm處得高約0.2 cm的橢圓形斑點(diǎn)，維生素A上行8.3 cm處得高約0.2 cm的圓形斑點(diǎn)，斑點(diǎn)分離度完好，Rf1=0.36，Rf2=0.92。故選擇以100%二氯甲烷為展開劑，層析上行9 cm。

圖1 不同展開劑的展開距離考察

2.1.2 幾種前處理方法的比較

為得到最優(yōu)的提取方法，依次對文獻(xiàn)采用的低溫酶解皂化法[21-22]、溶劑直接萃取法[23]、固相萃取法[24]分別進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)與試驗(yàn)優(yōu)化的TLC法進(jìn)行比較。

通過對4種提取方法的提取回收率進(jìn)行比較，溶劑直接萃取法、低溫酶解皂化法和TLC分離法提取2種維生素的平均回收率均達(dá)90%以上，而經(jīng)固相萃取法后平均回收率在70%～80%之間，這與文獻(xiàn)[25-26]報(bào)道一致。溶劑直接萃取法和TLC分離法均采用有機(jī)溶劑直接破壁同時(shí)提取，而低溫酶解皂化法以及固相萃取法采用皂化法進(jìn)行破壁處理，明顯發(fā)現(xiàn)當(dāng)皂化處理奶粉樣品的時(shí)候，會造成脂溶性維生素的損失，采用酶溶液處理后再在較低溫度下破壁處理時(shí)，能減少母乳中的脂溶性維生素?fù)p失，但就相對有機(jī)溶劑破壁和提取而言，提取率仍較低。由此可見，4種前處理方法中TLC分離法能夠得到最佳回收率。

各前處理方法所得的添加混合標(biāo)準(zhǔn)品的樣品溶液HPLC色譜圖如圖2所示。TLC分離法的雜質(zhì)峰數(shù)量少，而且與主成分分離度完好，不干擾主成分的出峰，為較為理想的前處理方法。

圖2 采用TLC方法得到的HPLC色譜圖

2.2 HPLC色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

在單一波長下采用紫外檢測器同時(shí)測定多種脂溶性維生素時(shí)需要選取最佳吸收波長，因此試驗(yàn)分別吸取2 mL維生素A與維生素E的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于190～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果得維生素A在324 nm處有最大吸收波長，維生素E在293 nm處有最大吸收波長，通過脂溶性維生素樣品在各波長下的分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測波長300 nm時(shí)，維生素A與維生素E均能得到較好響應(yīng)值。

2.2.2 流動相的選擇

結(jié)合文獻(xiàn)[26-27]報(bào)道，試驗(yàn)對以甲醇為基礎(chǔ)溶劑的溶劑體系甲醇、甲醇-水（9∶1，V/V）、甲醇-異丙醇-醋酸緩沖鹽（9∶1，V/V）作流動相時(shí)的分離效果進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水（9∶1，V/V）為流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，基線發(fā)生嚴(yán)重漂移，待測物保留時(shí)間穩(wěn)定性差；以甲醇-異丙醇-醋酸緩沖鹽（9∶1，V/V）為流動相時(shí)，基線平穩(wěn)，但維生素A出峰的時(shí)間窗內(nèi)有一很強(qiáng)的雜質(zhì)峰，會對維生素A的出峰會造成一定程度上的干擾；以甲醇為流動相時(shí)，維生素A與維生素E能在10 min內(nèi)完全分離，基線平穩(wěn)，維生素A和維生素E保留時(shí)間穩(wěn)定性好，峰形完好，雜質(zhì)峰與主峰分離度較好，因此試驗(yàn)選擇甲醇作為流動相，維生素A的保留時(shí)間為3.65 min，維生素E的保留時(shí)間為8.02 min。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性范圍，檢出限與定量限

利用配制成的空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按5，10，50，100，200和500 μg/L的水平添加，進(jìn)樣檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以峰面積Y對進(jìn)樣質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，以RSN=3計(jì)算檢出限，以RSN=10計(jì)算定量限）。以空白奶粉基質(zhì)溶液添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測得2種維生素的檢出限與定量限。由表1可知，2種藥物的質(zhì)量濃度在5～500 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表1 維生素A和維生素E的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確度用回收率表示，分別加入高、中、低3種質(zhì)量濃度（5，10和20 μg/L）混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按照1.3.5的樣品處理方法制備奶粉樣品，取10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算回收率及RSD。通過連續(xù)5 d進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，以回收率表示方法的準(zhǔn)確度，x±s表示方法的精密度。根據(jù)分析，維生素A和維生素E的回收率82%～98%，變異系數(shù)≤15.5%。這些數(shù)據(jù)均符合分析方法標(biāo)準(zhǔn)對準(zhǔn)確度和精密度的要求。

2.4 樣品測定

取3份母乳樣品，考慮到母乳樣品中可能含有的待測組分超過方法的線性范圍，按1.3的制備方法制備樣品，然后分別稀釋5倍進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中2種維生素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù)表2顯示，3份母乳樣品中均檢出維生素A與維生素E。

根據(jù)2016版《中國居民膳食指南》規(guī)定，結(jié)合0～1歲嬰兒的母乳攝入量分析，2份母乳樣品維生素A和維生素E含量都處于0～1歲嬰兒推薦量之內(nèi)。編號2母乳維生素A和維生素E含量偏高，但是還未超出0～1歲嬰兒可耐受最高攝入量。經(jīng)進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)產(chǎn)婦自行加倍服用多種復(fù)合維生素，所以建議乳母要合理用藥。

表2 3份母乳樣品中維生素A和維生素E的分析結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立TLC-HPLC法檢測母乳中的2種脂溶性維生素。通過前處理方法的選擇和優(yōu)化，得出TLC提取分離的最佳工藝條件。根據(jù)方法學(xué)考察結(jié)果，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可作為母乳中2種脂溶性維生素的有效檢測方法。通過對母乳樣品進(jìn)行檢測，為哺乳期婦女的營養(yǎng)和合理用藥提供技術(shù)支持。