葡萄酒中生物胺含量分析和控制措施

劉睿，王琳，畢會芳，孫德鵬，車明秀，胡明燕

山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）

生物胺是由食品微生物的酶促氨基酸脫羧反應產生的，具有生物活性的一類小分子堿性含氮有機化合物。生物胺普遍存在于魚類及其制品、奶酪、黃酒、葡萄酒等食品中。按照化學結構，可以將生物胺分為脂肪胺（腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、胍丁胺）、芳香胺（2-苯乙胺、酪胺、章魚胺）和雜環胺（組胺、色胺、5-羥色胺）；而雜環胺又可細分為咪唑胺（組胺）和吲哚胺（色胺和5-羥色胺）；按氨基數量可將生物胺分為單胺、二胺和多胺[1]。微量的生物胺是生物體內正常的活性成分，但當人體攝入過量的生物胺時，就會引起頭痛、惡心等食源性生物胺中毒，嚴重會危及生命。另外，精胺、亞精胺和胍丁胺等生物胺是致癌物亞硝胺的前提物質[1]。

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經全部或部分發酵釀制而成的，含有一定酒精度的發酵酒。葡萄酒中的生物胺含量與原料的衛生狀況、發酵過程中微生物的代謝以及發酵過程的參數等均有關系[2]。由于酒類的主要成分乙醇（以及微量成分乙醛）能夠顯著增強生物胺的毒性，因此酒類中所允許的生物胺含量應低于其他食品[1]。一些葡萄酒生產國要求葡萄酒中組胺的含量不得超過：德國2 mg/L，比利時5～6 mg/L，瑞士和澳大利亞10 mg/L，法國8 mg/L，荷蘭2 mg/L[3]。我國尚未明確葡萄酒中生物胺的限量要求。葡萄酒中生物胺含量的測定主要通過液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法以及最近新開發的傳感器技術進行檢測[4]。

根據GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中液相色譜法測定葡萄酒樣本中的9種生物胺含量，并對其進行分析研究。同時對葡萄酒中生物胺的產生原因及控制措施進行系統分析，并對葡萄酒生物胺限量的制定及進一步監管提出意見和建議，以促進我國葡萄酒行業綠色健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品牌葡萄酒樣本100批次（其中含國產葡萄酒80批次，進口葡萄酒20批次），市售。乙腈、正己烷、乙酸、乙酸銨，均為色譜純，海阿拉丁；丙酮，色譜純，天津康科德；乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸，均為分析純，上海國藥；丹磺酰氯，純度＞99%，上海國藥；1, 7-二氨基庚烷，純度＞98%，Bepure；2-苯乙胺，純度＞98%，Bepure；亞精胺三鹽酸鹽，純度＞97%，Bepure；尸胺，純度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；鹽酸章魚胺，純度＞97%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；精胺四鹽酸鹽，純度＞97%，Bepure；組胺二鹽酸鹽，純度＞99%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；腐胺二鹽酸鹽，純度＞98%，Bepure；色胺，純度＞99%，Bepure；酪胺鹽酸鹽，純度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH。

高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司；電子天平，梅特勒-托利多公司；離心機，德國Sigma公司；均質機，德國IKA公司；超純水發生器，美國密理博公司；酸度計，梅特勒-托利多公司；氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；濾膜針頭濾器，0.22 μm。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗原理

試樣用丹磺酰氯衍生，C18色譜組分離，以1, 7-二氨基庚烷為內標，高效液相色譜儀檢測，內標法定量。

1.2.2 試劑配制

內標溶液配制：準確稱取適量內標標準品，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后稀釋至刻度，混勻，配制成質量濃度為10 mg/mL的內標標準儲備溶液，置-20 ℃冰箱儲存。吸取上述內標標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，作為內標標準中間使用液。吸取1.0 mL內標標準中間使用液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，作為內標使用液。

衍生試劑配制：準確稱取適量丹磺酰氯，以丙酮為溶劑配制質量濃度為10 mg/mL的衍生劑使用液，置4 ℃冰箱避光儲存。

生物胺標準系列溶液配制：分別吸取1.0 mL各生物胺單組分標準儲備溶液，置于同一個10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標準混合使用液（100 mg/L）。分別吸取0.10，0.25，0.50，1.0，1.50，2.50和5.0 mL生物胺標準混合使用溶液（100 mg/L），置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，使其質量濃度分別為1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0和50.0 mg/L。

1.2.3 試樣制備

準確量取1.0 mL樣品于15 mL塑料離心管中，依次加入250 μL內標溶液（100 mg/L）、1 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、1 mL衍生試劑，渦旋混勻1 min后置于60 ℃恒溫水浴鍋中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應15 min，取出冷卻至室溫，于每個離心管中加入1 mL超純水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮（約1 mL），加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至完全溶解，再加入5 mL乙醚萃取，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，轉移上層有機相（乙醚層）于15 mL離心管中，水相（下層）再次用乙醚萃取，合并兩次萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，經0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，待測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱，Xbridge C18，3.5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相，甲醇（A）-20 mmol/L醋酸銨（B）；檢測器，紫外檢測器（波長254 nm）；柱溫，35 ℃；流速，1.00 mL/min；進樣體積，10 μL。

以此色譜條件將標準品和樣品色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中各組分的色譜峰。

1.2.5 標準曲線繪制

分別移取1 mL生物胺標準系列溶液，置于10 mL具塞試管中，依次加入250 μL內標使用液（100 mg/L），以下操作同試樣的衍生步驟。將20 μL系列混合標準工作液的衍生液分別注入高效液相色譜儀，測得目標化合物的峰面積，以系列混合標準工作液的濃度為橫坐標，以目標化合物的峰面積與內標的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 樣品測定

將試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中，測得峰面積，以保留時間定性。根據標準曲線得到待測液中各目標化合物的濃度。

根據上述試驗步驟，測定葡萄酒試樣中9種生物胺含量，每個樣品平行測定2次，結果取平均值。

2 生物胺檢測結果與分析

2.1 生物胺檢測結果

根據GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》，采用高效液相色譜法對100批次葡萄酒樣品中的9種生物胺進行了檢測，詳細結果見表1和表2。

對全部葡萄酒樣品生物胺總量及各生物胺組分檢出率進行統計，結果見圖1。此次研究結果共7批次樣品未測出生物胺，檢出率為93%。其中檢出率超過50%的生物胺組分分別為腐胺（90%）、組胺（73%）、酪胺（68%）和章魚胺（53%）。對比國產和進口葡萄酒，檢出率均在50%以上的生物胺為腐胺、組胺和酪胺，說明這3種生物胺在葡萄酒中存在最普遍。

表1 國產葡萄酒各生物胺組分含量 mg/L

表2 進口葡萄酒各生物胺組分含量 mg/L

圖1 國產和進口葡萄酒各生物胺組分檢出率比較

對全部葡萄酒樣品生物胺總量及各生物胺組分平均檢出值進行統計，結果見圖2。對比國產和進口葡萄酒生物胺總量及各生物胺組分的平均檢出值進行分析，國產葡萄酒的生物胺總量明顯高于進口葡萄酒；對于檢出率較高的3種生物胺，國產和進口葡萄酒中的含量均較高，且平均檢出值國產葡萄酒明顯高于進口葡萄酒。

圖2 國產和進口葡萄酒各生物胺組分平均檢出值比較

GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中液相色譜法規定了葡萄酒中各生物胺的檢出限和定量限。依據國家標準對國產和進口葡萄酒中各生物胺組分檢出率進行統計，結果見圖3。國家標準檢出限和定量限檢出率國產葡萄酒整體高于進口葡萄酒。

圖3 生物胺組分檢出率

2.2 國產葡萄酒與進口葡萄酒生物胺含量對比分析

此次研究采購的葡萄酒樣本為中低檔葡萄酒，國產葡萄酒以中檔葡萄酒為主，進口葡萄酒以較為低端的餐酒為主。對比國產和進口葡萄酒各生物胺檢出率、平均檢出值、國家標準檢出限及定量限檢出率進行分析，國產葡萄酒和進口葡萄酒腐胺、組胺和酪胺檢出率較高，且國產葡萄酒中各生物胺含量明顯高于進口葡萄酒。根據我國生物胺檢測國家標準，國產葡萄酒生物胺檢出情況要高于進口葡萄酒。

由此可見，我國葡萄酒生物胺含量的控制需進一步改善。

3 控制措施與建議

3.1 葡萄酒中生物胺產生原因及控制措施

葡萄酒中存在多種生物胺，來自葡萄果實和發酵過程。大量研究表明，葡萄果實中存在腐胺、亞精胺、尸胺、組胺等多種生物胺，其中生物胺的種類和含量受品種、產地、年份、氣候、土壤、栽培處理及成熟度等影響[6-7]。葡萄酒釀造包括兩個階段：第一階段為物理化學或物理學階段，即在釀造紅葡萄酒時，葡萄漿果中的固體成分通過浸漬進入葡萄汁，在釀造白葡萄酒時，通過壓榨獲得葡萄汁；第二階段為生物學階段，即酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵（MLF）階段[8]。

大量研究表明，葡萄酒中的生物胺主要來源于發酵過程，釀造工藝的選擇對于保證葡萄酒的安全性很重要。影響生物胺含量的因素主要是前提氨基酸、釀酒微生物，以及發酵過程的控制[7,9-21]。葡萄酒生產過程中生物胺的控制手段主要有：（1）選擇品質優良、衛生狀況好的葡萄原料；（2）接種無組氨酸脫羧酶活性的菌株進行MLF；（3）MLF結束后立即對乳酸菌進行清除，可采用添加足夠的二氧化硫，添加化學抑制劑或進行瞬間高溫滅菌等工藝[7,9-21]。

3.2 建議

3.2.1 制定葡萄酒中生物胺限量要求與相應法規

2011年國務院食品安全委員會辦公室印發了《關于進一步加強酒類質量安全工作的通知》（食安辦[2011]23號），要求加強對白酒、葡萄酒、黃酒等生產加工過程產生的生物胺的風險檢測和評估。建議監管部門嚴格按照國家要求，建立生物胺風險評估體系，并制定葡萄酒中生物胺的限量要求與相應法規。

3.2.2 加大監管力度，并利用快速檢測方法提高監管效率

建議相關監督管理部門能夠加大對葡萄酒行業的監督管理力度，對葡萄酒中生物胺等知識進行宣貫普及。通過調研、試驗、驗證等方式增加生物胺的快速檢測方法，以提高監管效率。

4 結論

采用GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》標準中規定的高效液相色譜法，依次對80批次國產葡萄酒和20批次進口葡萄酒中的生物胺含量進行了檢測與分析。結果表明，國產葡萄酒與進口葡萄酒生物胺含量的控制尚存在著一定的差距，應持續改進我國葡萄酒中生物胺含量的控制手段，在實際生產中選擇品質及衛生狀況優良的葡萄果實和適當的釀造工藝，可以相應降低葡萄酒中生物胺的產生。建議監督管理部門制定葡萄酒中生物胺限量標準，增進監督管理手段和監管力度，以確保我國葡萄酒行業的健康發展。