流式細胞術檢測精子凋亡與男性不育癥關系研究

孫紅勇，林法喜*

（南京醫科大學第一附屬醫院，江蘇 南京 210029）

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2018年1月～2020年1月江蘇省人民醫院男性不育癥患者50例，年齡27～49歲，平均（33.5±5.4）歲。在精子癥類型方面，弱精子癥14例（28.0%），少精子癥36例（72.0%）。將這些患者作為不育癥組，另回顧性選取同期我院正常生育男性50例作為正常生育組，年齡26～48歲，平均（32.3±5.2）歲。兩組男性的一般資料比較差異均不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）性生活均正常；（2）夫婦婚后均同居1年以上。排除標準：（1）女方不孕因素；（2）避孕。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與設備

購買北京航天瑞麒科技發展有限公司生產的敬業分析儀，美國BD公司生產的FITC-Annexin V/PI熒光染色試劑（貨號：556547）。

1.3.2 精子凋亡檢測

在離心管中放置標本，將PBS液加入其中，洗滌2次，進行10 min離心，將速率設定為3000 r/min，將上清液去除，在-80℃冰箱中凍存精子備用。在冰水中放置精子標本復溫，用冷PBS液對精子懸液進行稀釋，在試管中加入約5×106個精子，將PBS液加入，洗滌，進行10 min的離心，將速率設定為3000 r/min，將上清液棄去。用1ml Annexin V Binding Buffer重懸浮，在試管中加入100 μL。將5 μL FITCAnnexin、10 μL PI加入染色，室溫下進行15 min避光靜置后將400 μL孵育緩沖液加入，終濃度約為1×106精子/mL。1 h內采用流式細胞儀，應用精子動（靜）態圖像分析系統分析精子密度、活力，將凋亡率（PAS）計算出來，計算方法為凋亡精子數與精子總數的百分率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0，計量資料用（±s）表示，用t檢驗；應用雙變量直線相關分析，將Pearson相關系數計算出來。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較

不育癥組弱精子癥患者的精液密度顯著高于少精子癥患者，差異有統計學意義（P＜0.05），凋亡率顯著低于少精子癥患者，差異有統計學意義（P＜0.05），但弱精子癥和少精子癥患者的A級精子、A+B級精子之間的差異均不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）。少精子癥患者的精子密度顯著低于正常生育組，差異有統計學意義（P＜0.05），凋亡率顯著高于正常生育組，差異有統計學意義（P＜0.05），但弱精子癥患者和正常生育組男性的精液密度、凋亡率之間的差異均不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）；弱精子癥、少精子癥患者的A級、A+B級精子均顯著低于正常生育組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較（±s）

表1 兩組男性的精液密度、A級、A+B級精子、凋亡率比較（±s）

組別 精子癥類型 密度（×106/mL） A級精子（%） A+B級精子（%） 凋亡率（%）不育癥組（n=50） 弱精子癥 84.0±13.5 12.8±2.0 25.5±4.9 8.8±1.4少精子癥 11.2±2.7 12.8±2.0 23.3±4.7 25.8±4.3正常生育組（n=50） 78.0±14.1 33.3±5.4 49.7±7.5 11.3±2.5

2.2 不育癥組患者的精液密度、A級、A+B級精子與凋亡率的相關性分析

不育癥組患者的精液密度與凋亡率呈顯著的負相關關系，差異有統計學意義（P＜0.05），但A級、A+B級精子與凋亡率之間無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不育癥組患者的精液密度、A級、A+B級精子與凋亡率的相關性分析

3 討 論

細胞凋亡指多細胞有機體由基因控制的細胞主動死亡過程，目的為對機體發育進行調控，對穩定的內環境進行維護。在精子發生過程中，精子凋亡是一個重要特征，在對正常精子數量進行維持的過程中，自發凋亡發揮著極為重要的作用。而誘發過多的生精細胞凋亡這一病理現象是異常的，會直接引發男性不育癥。本研究結果表明，不育癥組弱精子癥患者的精液密度顯著高于少精子癥患者，凋亡率顯著低于少精子癥患者。少精子癥患者的精子密度顯著低于正常生育組，凋亡率顯著高于正常生育組；弱精子癥、少精子癥患者的A級、A+B級精子均顯著低于正常生育組。不育癥組患者的精液密度與凋亡率呈顯著的負相關關系，說明少精子癥發生的一個原因可能為精子過量凋亡。

20世紀70年代，流式細胞術發展起來，其能夠以較快的速度定量分析單細胞，目前已經在各個領域廣泛應用。胞漿、核染色質在細胞凋亡的情況下濃縮，核裂解，促進凋亡小體的產生，相應改變細胞的光散射性質，而在對光散射進行測定的過程中，流式細胞術是極為簡單的細胞凋亡檢測方法，其一方面能夠定性，另一方面還能夠定量，具有較快的檢測速度、較大的數據采集量、較為客觀、全面的分析等，這就將一種較為理想的手段提供給了臨床對不同原因引發精子凋亡進行深入研究的工作，同時，在對精子功能、男性生育力進行評估的過程中，流式細胞術也可以作為一種新方法，應用前景極為廣闊。

綜上所述，男性不育癥與流式細胞術檢測精子凋亡關系密切，值得臨床充分重視。