非小細胞肺癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達變化及與臨床病理參數的關系

郭 毅 郭 偉 王艷紅

1.山西醫科大學基礎醫學院，山西太原 030003；2.山西省腫瘤醫院呼吸二科，山西太原 030003；3.山西醫科大學微生物學與免疫學教研室，山西太原 030000

全球范圍內，肺癌是發病率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的類型，多數患者發現時已處于中晚期，失去手術治療的最佳時機[2]。因此需深入研究NSCLC 疾病發生發展的機制，尋找有臨床意義的診斷治療靶點。微小RNA（miRNA）是內源性長度為18～25 個核苷酸的非編碼RNA 因子，在炎癥、免疫、腫瘤等疾病中均發揮重要的生物學調控作用[3]。miR-582-5p 位于人類染色體5q12.1，其在前列腺癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中均存在異常表達降低的現象，可通過負性調控轉化生長因子β 信號通路的傳導，發揮腫瘤抑制基因的功能。Rab27a 基因編碼的蛋白質屬于小基團轉移聚合（GTP）酶家族成員，參與蛋白質運輸和小GTP 酶介導的信號轉導。Rab27a 具有癌基因的作用，腫瘤發生時Rab27a 蛋白表達顯著上調，促進腫瘤細胞的惡性增殖、浸潤及化療耐藥性的產生[6-7]。目前在NSCLC 中miR-582-5p 與Rab27a 表達及二者間的關系報道較少。本研究通過檢測NSCLC癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月—2018 年12 月山西省腫瘤醫院（以下簡稱“我院”）診斷并行手術治療的120 例NSCLC 患者的臨床病理資料。納入標準：①經術后病理學檢查確診為NSCLC，由兩位病理醫師共同閱片判斷；②所有患者均為初次診治，未接受過放化療等抗腫瘤治療；③臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標準：①合并有感染性疾病，如呼吸道感染、結核等；②既往或同時伴其他器官系統惡性腫瘤；③合并肝腎等臟器功能不全。年齡42～63 歲，平均（51.5±6.5）歲；男70 例，女50 例；病理類型：肺腺癌81 例，肺鱗癌39 例；腫瘤直徑：≤5 cm 者77 例，＞5 cm 者43 例；腫瘤TNM 分期[8]：Ⅰ期41 例，Ⅱ期43 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期6 例；腫瘤分化：高分化33 例，中分化41 例，低分化46 例；伴淋巴結轉移49 例，無淋巴結轉移71 例。所有患者及家屬對本研究均知情同意并簽字，本研究經我院醫學倫理委員會審核批準通過。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測組織中miR-582-5p 及Rab27a 表達 收集離體30 min以內的癌組織標本，以距癌組織邊緣3 cm 以上且經病理檢查證實為正常肺組織作為癌旁對照，-80℃保存。取約50 mg 組織，加入1 mL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，組織勻漿機勻碎組織，4℃離心10 min，轉速10 000 r/min，離心半徑為10 cm，TRIzol 法提取組織中總RNA。以總RNA 為模板，分別用反轉錄試劑盒及TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒合成cDNA。qPCR反應體系10 μL，包括1 μL cDNA，1 μL 上游及下游引物、5 μL Taq Master MixⅡ及2 μL 無RNA 酶水。miR-582-5p 引物上游序列：5’-UUACAGUUCAACCAGUUACU-3’，反向引物序列：5’-UAACUGGUUGAACAACUGUAAUU-3’，內參基因GAPDH 上游引物序列：5’-AATCTCCACTTTGCCACTG-3’，下游引物序列：3’-CCTCGTCCCGTAGACAAAA-5’；Rab27a 上游引物序列：5’-AAGAGGAGGAAGCCATAGCAC-3’，下游引物序列：5’-CCA'ITGGCAGCACTAGT'ITC-3’，β-actin 上游引物序列：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物序列：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 min，62℃退火50 s，72℃延伸10 s，共40 個循環。結果以2-ΔCt值法表示，ΔCt=CtmiR-582-5p/Rab27a-CtGAPDH/β-actin。

1.2.2 免疫印跡檢測組織中Rab27a 蛋白表達 將組織勻漿上清加入細胞裂解液，裂解15 min。取上清蛋白定量后，加入上樣緩沖液，95℃水浴10 min。進行SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒壓80 V 轉印2 h。將PVDF 膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h；Rab27a 一抗（稀釋比1∶3000，購自abcam 公司，貨號：ab55667）4℃孵育過夜；二抗（1∶5000）中孵育，室溫1 h。ECL 暗室顯影照相。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，組間均數比較采用兩獨立樣本t 檢驗。Pearson 線性相關分析miR-582-5p 和Rab27a 表達的相關性。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達比較

癌組織與癌旁組織miR-582-5p 相對表達量分別為0.312±0.084、0.755±0.132，Rab27a 的mRNA 相對表達量分別為0.911±0.215、0.203±0.051。癌組織miR-582-5p 相對表達量明顯低于癌旁組織（t=31.016，P ＜0.001），而Rab27a 的mRNA 相對表達量顯著高于癌旁組織（t=35.099，P ＜0.001）。部分病例癌組織與癌旁組織中Rab27a 蛋白表達的蛋白質印跡結果，見圖1。

圖1 部分病例癌組織與癌旁組織中Rab27a 蛋白表達

2.2 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達與臨床病理特征的關系

與TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移癌組織比較，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結轉移的患者癌組織中miR-582-5p 表達較低，而Rab27a 表達較高，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。不同年齡、性別、病理類型、組織學分化、腫瘤直徑的患者癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達比較，差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。見表1。

表1 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達與臨床病理特征的關系（）

表1 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達與臨床病理特征的關系（）

2.3 NSCLC 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達的關系

NSCLC 癌組織中miR-582-5p 相對表達量與Rab27a 相對表達量呈顯著負相關（r=-0.633，P=0.000）。

3 討論

NSCLC 是常見的肺癌類型，每年肺癌死亡的例數高達150 萬人，特別是伴有轉移的患者生存預后較差，5 年整體生存率僅為11%[9-10]。因此有必要深入研究NSCLC 的發病機制，尋找有臨床意義的診斷治療靶點。非編碼RNA 如miRNA、環狀RNA 及長鏈非編碼RNA 等在腫瘤的發生發展中發揮重要的調控作用，可通過影響相關癌基因及抑癌基因的表達，對腫瘤細胞增殖、凋亡及浸潤轉移等行為發揮重要的調控作用[11-13]。

miRNA 是小的非編碼RNA 分子，在轉錄后水平對基因表達進行調控。miRNA 在多種惡性腫瘤中如胰腺癌[14]、乳腺癌[15]及甲狀腺癌[16]等均存在異常表達的現象，有利于腫瘤的早期診斷、治療及預后判斷。本研究中，NSCLC 癌組織中miR-582-5p 的相對表達量低于癌旁組織。其機制尚不清楚，可能與長非編碼RNA 對miR-582-5p 的表達調控作用有關。研究表明長鏈非編碼RNA 如尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）能競爭結合并抑制miR-582-5p 的表達，導致miR-582-5p 表達水平降低，促進腫瘤細胞惡性增殖和浸潤轉移[17]。此外，本研究中，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結轉移的NSCLC 癌組織中miR-582-5p 表達水平較低，提示miR-582-5p 可能是一種抑癌基因，抑制NSCLC的發生發展。有研究表明，腫瘤發生時miR-582-5p 能夠抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶2（MAPKK2）表達的能力，使腫瘤細胞過度增殖，導致腫瘤分期升高[18]。此外，miR-582-5p 具有抑制轉化生長因子-β信號通路中的轉錄因子SMAD2 表達的作用，腫瘤發生時miR-582-5p 降低導致SMAD2 過度激活下游癌基因的表達，導致腫瘤發生遠處轉移[4]。

Rab27a 是RAS 癌基因家族成員，具有小GTP 酶的功能，近年來研究發現腫瘤發生時其過度激活，導致腫瘤細胞的局部浸潤及遠處轉移，有望成為腫瘤診斷、治療及預后判斷的腫瘤標志物[19]。本研究中，NSCLC癌組織中Rab27a 的mRNA 相對表達量及蛋白明顯高于癌旁組織，其原因一方面可能是NSCLC 中Rab27a 基因擴增導致Rab27a 表達增加[20]；另一方面與Rab27a 基因的轉錄后調控異常有關。有報道表明腫瘤發生時miR-124 等結合并抑制Rab27a 表達的能力降低，使Rab27a mRNA 的穩定性增加，促進腫瘤的惡性進展[21-22]。本研究中，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結轉移的NSCLC 癌組織中Rab27a 表達水平明顯較高，其原因可能是Rab27a 表達增加后能夠促進組織蛋白酶D 的表達，降解細胞間基質成分，從而促進腫瘤細胞的淋巴轉移[23-24]。此外，Rab27a 表達的增加能夠激活核因子κB 通路，促進腫瘤細胞的增殖相關基因的表達，導致腫瘤分期升高[6]。本研究中，NSCLC 癌組織中Rab27a 與miR-582-5p 的相對表達量呈明顯負相關，Rab27a 表達可能是受miR-582-5p 的表達調控，miR-582-5p 能夠結合于Rab27a mRNA 的3’非編碼區，降低Rab27a mRNA 穩定性，導致Rab27a 表達下降[25]。

綜上所述，NSCLC 癌組織中miR-582-5p 表達降低，而Rab27a 表達升高，兩者有可能成為新的NSCLC診斷、治療的分子標志物，但兩者之間的具體作用機制及臨床意義需進一步研究證實。