非小細(xì)胞肺癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達(dá)變化及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

郭 毅 郭 偉 王艷紅

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原 030003；2.山西省腫瘤醫(yī)院呼吸二科，山西太原 030003；3.山西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，山西太原 030000

全球范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見(jiàn)的類型，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[2]。因此需深入研究NSCLC 疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有臨床意義的診斷治療靶點(diǎn)。微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性長(zhǎng)度為18～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 因子，在炎癥、免疫、腫瘤等疾病中均發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控作用[3]。miR-582-5p 位于人類染色體5q12.1，其在前列腺癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中均存在異常表達(dá)降低的現(xiàn)象，可通過(guò)負(fù)性調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮腫瘤抑制基因的功能。Rab27a 基因編碼的蛋白質(zhì)屬于小基團(tuán)轉(zhuǎn)移聚合（GTP）酶家族成員，參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸和小GTP 酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rab27a 具有癌基因的作用，腫瘤發(fā)生時(shí)Rab27a 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、浸潤(rùn)及化療耐藥性的產(chǎn)生[6-7]。目前在NSCLC 中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)及二者間的關(guān)系報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達(dá)，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月—2018 年12 月山西省腫瘤醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）診斷并行手術(shù)治療的120 例NSCLC 患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為NSCLC，由兩位病理醫(yī)師共同閱片判斷；②所有患者均為初次診治，未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療；③臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有感染性疾病，如呼吸道感染、結(jié)核等；②既往或同時(shí)伴其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤；③合并肝腎等臟器功能不全。年齡42～63 歲，平均（51.5±6.5）歲；男70 例，女50 例；病理類型：肺腺癌81 例，肺鱗癌39 例；腫瘤直徑：≤5 cm 者77 例，＞5 cm 者43 例；腫瘤TNM 分期[8]：Ⅰ期41 例，Ⅱ期43 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期6 例；腫瘤分化：高分化33 例，中分化41 例，低分化46 例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71 例。所有患者及家屬對(duì)本研究均知情同意并簽字，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)組織中miR-582-5p 及Rab27a 表達(dá) 收集離體30 min以內(nèi)的癌組織標(biāo)本，以距癌組織邊緣3 cm 以上且經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常肺組織作為癌旁對(duì)照，-80℃保存。取約50 mg 組織，加入1 mL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，組織勻漿機(jī)勻碎組織，4℃離心10 min，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，離心半徑為10 cm，TRIzol 法提取組織中總RNA。以總RNA 為模板，分別用反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。qPCR反應(yīng)體系10 μL，包括1 μL cDNA，1 μL 上游及下游引物、5 μL Taq Master MixⅡ及2 μL 無(wú)RNA 酶水。miR-582-5p 引物上游序列：5’-UUACAGUUCAACCAGUUACU-3’，反向引物序列：5’-UAACUGGUUGAACAACUGUAAUU-3’，內(nèi)參基因GAPDH 上游引物序列：5’-AATCTCCACTTTGCCACTG-3’，下游引物序列：3’-CCTCGTCCCGTAGACAAAA-5’；Rab27a 上游引物序列：5’-AAGAGGAGGAAGCCATAGCAC-3’，下游引物序列：5’-CCA'ITGGCAGCACTAGT'ITC-3’，β-actin 上游引物序列：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物序列：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 min，62℃退火50 s，72℃延伸10 s，共40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-ΔCt值法表示，ΔCt=CtmiR-582-5p/Rab27a-CtGAPDH/β-actin。

1.2.2 免疫印跡檢測(cè)組織中Rab27a 蛋白表達(dá) 將組織勻漿上清加入細(xì)胞裂解液，裂解15 min。取上清蛋白定量后，加入上樣緩沖液，95℃水浴10 min。進(jìn)行SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒壓80 V 轉(zhuǎn)印2 h。將PVDF 膜放入5%脫脂牛奶中封閉1 h；Rab27a 一抗（稀釋比1∶3000，購(gòu)自abcam 公司，貨號(hào)：ab55667）4℃孵育過(guò)夜；二抗（1∶5000）中孵育，室溫1 h。ECL 暗室顯影照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。Pearson 線性相關(guān)分析miR-582-5p 和Rab27a 表達(dá)的相關(guān)性。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)比較

癌組織與癌旁組織miR-582-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為0.312±0.084、0.755±0.132，Rab27a 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.911±0.215、0.203±0.051。癌組織miR-582-5p 相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織（t=31.016，P ＜0.001），而Rab27a 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織（t=35.099，P ＜0.001）。部分病例癌組織與癌旁組織中Rab27a 蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1 部分病例癌組織與癌旁組織中Rab27a 蛋白表達(dá)

2.2 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

與TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織比較，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中miR-582-5p 表達(dá)較低，而Rab27a 表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。不同年齡、性別、病理類型、組織學(xué)分化、腫瘤直徑的患者癌組織中miR-582-5p、Rab27a 的表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表1 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

2.3 NSCLC 癌組織中miR-582-5p 與Rab27a 表達(dá)的關(guān)系

NSCLC 癌組織中miR-582-5p 相對(duì)表達(dá)量與Rab27a 相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.633，P=0.000）。

3 討論

NSCLC 是常見(jiàn)的肺癌類型，每年肺癌死亡的例數(shù)高達(dá)150 萬(wàn)人，特別是伴有轉(zhuǎn)移的患者生存預(yù)后較差，5 年整體生存率僅為11%[9-10]。因此有必要深入研究NSCLC 的發(fā)病機(jī)制，尋找有臨床意義的診斷治療靶點(diǎn)。非編碼RNA 如miRNA、環(huán)狀RNA 及長(zhǎng)鏈非編碼RNA 等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可通過(guò)影響相關(guān)癌基因及抑癌基因的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用[11-13]。

miRNA 是小的非編碼RNA 分子，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA 在多種惡性腫瘤中如胰腺癌[14]、乳腺癌[15]及甲狀腺癌[16]等均存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，有利于腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后判斷。本研究中，NSCLC 癌組織中miR-582-5p 的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織。其機(jī)制尚不清楚，可能與長(zhǎng)非編碼RNA 對(duì)miR-582-5p 的表達(dá)調(diào)控作用有關(guān)。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA 如尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并抑制miR-582-5p 的表達(dá)，導(dǎo)致miR-582-5p 表達(dá)水平降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[17]。此外，本研究中，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 癌組織中miR-582-5p 表達(dá)水平較低，提示miR-582-5p 可能是一種抑癌基因，抑制NSCLC的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，腫瘤發(fā)生時(shí)miR-582-5p 能夠抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶2（MAPKK2）表達(dá)的能力，使腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致腫瘤分期升高[18]。此外，miR-582-5p 具有抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子SMAD2 表達(dá)的作用，腫瘤發(fā)生時(shí)miR-582-5p 降低導(dǎo)致SMAD2 過(guò)度激活下游癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。

Rab27a 是RAS 癌基因家族成員，具有小GTP 酶的功能，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生時(shí)其過(guò)度激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有望成為腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物[19]。本研究中，NSCLC癌組織中Rab27a 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量及蛋白明顯高于癌旁組織，其原因一方面可能是NSCLC 中Rab27a 基因擴(kuò)增導(dǎo)致Rab27a 表達(dá)增加[20]；另一方面與Rab27a 基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。有報(bào)道表明腫瘤發(fā)生時(shí)miR-124 等結(jié)合并抑制Rab27a 表達(dá)的能力降低，使Rab27a mRNA 的穩(wěn)定性增加，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[21-22]。本研究中，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 癌組織中Rab27a 表達(dá)水平明顯較高，其原因可能是Rab27a 表達(dá)增加后能夠促進(jìn)組織蛋白酶D 的表達(dá)，降解細(xì)胞間基質(zhì)成分，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移[23-24]。此外，Rab27a 表達(dá)的增加能夠激活核因子κB 通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤分期升高[6]。本研究中，NSCLC 癌組織中Rab27a 與miR-582-5p 的相對(duì)表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)，Rab27a 表達(dá)可能是受miR-582-5p 的表達(dá)調(diào)控，miR-582-5p 能夠結(jié)合于Rab27a mRNA 的3’非編碼區(qū)，降低Rab27a mRNA 穩(wěn)定性，導(dǎo)致Rab27a 表達(dá)下降[25]。

綜上所述，NSCLC 癌組織中miR-582-5p 表達(dá)降低，而Rab27a 表達(dá)升高，兩者有可能成為新的NSCLC診斷、治療的分子標(biāo)志物，但兩者之間的具體作用機(jī)制及臨床意義需進(jìn)一步研究證實(shí)。