TLR4在龍血竭抑制肝癌細胞生長中的作用

石禹，姚行，韋路絲，趙訓曉，李妃，肖曼，王晗

海南醫學院生理學教研室，海南 海口 571199

肝癌是目前世界上死亡率極高的癌癥之一，因為其早期無明顯的癥狀，晚期治療困難，導致治療效果不佳[1]。相關研究發現，中草藥龍血竭不僅有活血化瘀的功效，同時也有抑制肝癌細胞生長的作用[2-3]，但龍血竭抑制肝癌細胞生長的機制尚不清楚。現有資料表明，TLR4不單表達于免疫細胞當中，它的沉默表達還能夠對肝癌細胞的生長產生影響[1，4-5]。為此，本課題以此為切入點，主要探究龍血竭是否通過調控toll 樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)基因的表達影響肝癌細胞的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 本研究所使用細胞為凍存于海南醫學院分子生物學重點實驗室的人肝癌細胞系HepG2和HepG2.2.15。

1.1.2 主要試劑 龍血竭購于中國(海南博大制藥廠)，高糖DMEM購于中國(Hyclone公司)，胎牛血清購于美國(BI公司)，青鏈霉素雙抗購于中國(上海碧云天公司)，DMSO 購于美國(SIGMA公司)，CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒購于日本(DOJINDO 公司)，Eastep Super Total RNA Extraction Kit 購于美國(Promega 公司)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix購于中國(北京全式金公司)，anti-TLR4抗體購于美國(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 培養肝癌細胞系HepG2 和HepG2.2.15，分別將以上兩種肝癌細胞隨機等量分為對照組和上藥組，上藥組在培養基中加入龍血竭，對照組僅加入等量細胞培養基。

1.2.2 細胞培養 配置含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 高糖培養基，將HepG2 細胞和HepG2.2.15 細胞置于其中，于37℃、5%CO2培養箱飽和濕度下培養，每1～2 d傳代一次。

1.2.3 細胞增殖抑制率檢測 將生長狀態至對數生長期的HepG2 細胞和HepG2.2.15 細胞進行消化，制備細胞懸液并計數，根據每孔4 000 個細胞的96 孔板中的細胞數量，配制濃度為 2×104個/mL 細胞懸液。向每孔加入200 μL 細胞懸液，培養箱培養24 h 待其貼壁。細胞貼壁后，棄去96 孔板中的培養基，加入100 L 不同濃度(濃度梯度分別為0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、140 μg/mL、160 μg/mL、180 μg/mL)的龍血竭培養基，再等待24 h。龍血竭處理24 h后，向每個孔中加入10 μL CCK-8，并置于5%CO2培養箱中30 min。每個孔的吸光度值在OD450下測量。測試后，將其放回37℃的培養箱中繼續反應，培養4 h 后終止。以龍血竭濃度為橫坐標，平均抑制率為縱坐標，繪制濃度-抑制率曲線。計算龍血竭作用于細胞后在每個孔中不同濃度的抑制率。抑制率(%)=(給藥OD 值－空白組OD值)/(不給藥OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測TLR4 mRNA 表達水平 利用總RNA 提取試劑盒提取各組細胞中的總RNA，再利用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA 進行逆轉錄，以β-actin[6]為內參，擴增后，以 2-ΔΔCt方法計算HepG2 和 HePG2.2.15 細胞中 TLR4 mRNA 的表達。所用引物序列為：TLR4 上游，5"-AGACCTGTCCCT GAACCCTAT-3"；TLR4 下 游 ，5"-CGATGGACTTCT AAACCAGCCA-3"[7]；β-actin 上游，5"-TCCTGTGGC ATCCACGAAACT-3"；β-actin下游，5"-GAAGCATTT GCGGTGGACGAT-3"。

1.2.5 Western-blot 檢測TLR4 蛋白表達水平 用BCA 蛋白定量法提取各組細胞并進行定量。然后經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、膜轉移和5%脫脂奶粉密封1 h。加一抗anti-TLR4抗體(1∶500)和anti-GAPDH 抗體 4℃溫育過夜。TBST 洗膜 3 次×10 min，二抗(1∶1 000)室溫溫育1 h，TBST洗膜3次×10 min，ECL 化學發光劑暗室顯影。

1.3 統計學方法 實驗中的所有數據均采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 龍血竭對HepG2 細胞和HepG2.2.15 細胞增殖的影響 采用CCK-8法進行細胞增殖檢測，龍血竭對HepG2 和HepG2.2.15 細胞增殖的影響見圖1。經24 h 不同濃度龍血竭處理的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞抑制率與藥物濃度呈正相關，當龍血竭濃度增加時細胞抑制率隨之增加。加入龍血竭后，HePG2、HePG2.2.15兩組細胞系生長速度明顯減慢，IC50值分別為(97.78±8.19)μg/mL和 (66.89±5.86)μg/mL。

2.2 龍血竭對HepG2 細胞和HepG2.2.15 細胞TLR4 mRNA 表達水平的影響 分別使用IC50 濃度的龍血竭處理HepG2細胞和HepG2.2.15細胞，提取各組總RNA 并逆轉錄，實時熒光定量方法檢測TLR4 mRNA的表達水平見表1。與未經龍血竭處理的細胞相比，經龍血竭處理的HepG2 和HepG2.2.15 細胞的TLR4 mRNA 表達水平明顯降低，且差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 龍血竭對HepG2 細胞和HepG2.2.15 細胞中TLR4mRNA 表達的影響

2.3 Western-blot 法檢測TLR4 的蛋白質表達水平 分別使用IC50 濃度的龍血竭處理HepG2 細胞和 HepG2.2.15 細胞，Western-blot 檢測 TLR4 蛋白的表達水平，結果見圖2。與未經龍血竭處理的細胞相比，經龍血竭處理的HepG2 和HepG2.2.15 細胞的TLR4 蛋白表達明顯降低[(0.89±0.05)vs(0.68±0.06)、(1.11±0.04) vs (0.56±0.08)]，且差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 龍血竭對HepG2細胞和HepG2.2.15細胞TLR4蛋白表達的影響

3 討論

人肝癌細胞系HepG2 來源于一位15 歲白人的肝癌組織，HepG2.2.15 細胞是由兩個頭尾相連的HBV-DNA全基因的重組質粒轉染HepG2細胞而建立的細胞系。本文主要是以HepG2 細胞和HepG2.2.15細胞為研究對象，用CCK8 法測得龍血竭在這兩種細胞中的IC50 濃度，并采用實時熒光定量PCR 和Western-blot 技術對龍血竭通過TLR4 作用于HepG2 細胞和HepG2.2.15細胞的可能性進行了研究。

原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤第四位，肝癌病情發展極快，死亡率居惡性腫瘤第三位，被稱為“癌中之王”[8]。長期的臨床實踐表明，中醫藥可以降低肝硬化患者的肝癌發病率，它在治療肝硬化方面有很好的優勢。OKA等[9]隨訪5 年，觀察小柴胡湯顆粒治療肝硬化的療效，結果發現，與安慰劑對照組相比，小柴胡湯可降低肝硬化患者肝癌的發病率和病死率。中藥成分多種多樣，其作用具有多渠道、多層次的綜合效應，也是其對復雜肝纖維化病理具有良好療效的重要基礎。

原始植物如龍血樹的木質部在受到外力破壞或被微生物侵入后會分泌紅色樹脂[10]。自古以來，這種樹脂被稱為血竭，是傳統名貴中藥[11]。現代藥理學研究證明血竭具有消炎、止血、鎮痛[12]、止瀉、抗潰瘍[13]、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，廣泛應用于跌打損傷、外傷出血、潰瘍、瘀滯疼痛等臨床治療。在預防和治療冠心病、缺血性心臟病和高脂血癥等方面也有很好的效果[14]。劍葉龍血樹是目前國產血竭的主要原料[15]，同時，近年來也發現海南島廣泛分布的常見植物柬埔寨龍血樹也能產生紅色樹脂，初步臨床醫學證明海南龍血竭的藥理和臨床效果與進口龍血竭基本相同[16]。相關研究還表明，海南龍血竭對人肝癌細胞的生長具有抑制作用[3]。本研究通過CCK8 法也證實了龍血竭能夠使肝癌細胞的生長受到抑制，抑制作用隨著龍血竭濃度的增加而逐漸增強。

TLR4全稱為Toll樣受體，作為炎癥信號傳遞過程中的一種門戶蛋白，它在免疫防御反應中發揮著重要作用。研究人員發現，TLR4 在許多不同組織的腫瘤細胞表面表達，這可能與腫瘤免疫微環境的建立和維持有關[17-19]。肝癌細胞的表面也有TLR4的表達，可能與介導肝癌的發生發展有相關聯系[20]。通過實時熒光定理PCR 和Western-blot 分別檢測兩種肝癌細胞系中TLR4 的mRNA 和蛋白表達水平，結果發現龍血竭能夠明顯抑制TLR4 的表達，證實龍血竭可能通過TLR4信號通路抑制了肝癌細胞的生長。本研究驗證了龍血竭對肝癌細胞確實起到抑制作用，并初步探討了龍血竭是否通過調控TLR4 基因對肝癌細胞起到抑制作用。

現有研究發現在肝免疫異常、炎癥反應觸發的肝損傷、肝星狀細胞的活化及肝纖維化惡化與肝癌的發展中TLR4-MyD88-NF-κB信號通路均有重要調節作用[21]，未來可在龍血竭是否通過調控TLR4-MyD88-NF-κB信號通路抑制肝癌細胞的生長的方向進行深入研究。

目前關于肝癌的研究很多，但能有效治愈肝癌的藥物數量仍然有限，本研究試圖通過探討龍血竭抑制肝癌細胞生長的機制，從而為肝癌的藥物治療提供新的思路，但找到徹底治愈肝癌藥物的研究仍然任重而道遠。