外周血T-SPOT.TB和38kD-IgG檢測在活動期結核病診斷中的應用

王永鋒，徐焰

西安大興醫院檢驗科，陜西 西安 710016

結核病是一種由結核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，感染結核分枝桿菌后機體通常會產生一系列細胞免疫和體液免疫變化，累及全身各個器官組織[1-2]。因此，對于結核病應盡早診斷并積極采取有效措施進行治療。然而，結核病早期臨床癥狀并不明顯，誤診情況時有發生。目前結核病的臨床診斷仍主要依靠細菌學檢測，然而其檢測過程復雜，檢測時間較長，且涂片敏感性較差，難以區分活菌、死菌和非結核分枝桿菌，不利于肺外結核的早期診斷[3]。抗結核抗體(38kD-IgG)和結核感染T 細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是近年來引入臨床檢測結核病的有效方法[4]，目前已廣泛應用于臨床。本研究通過對比38kD-IgG、T-SPOT.TB 試驗在診斷活動期結核病上的診斷價值，旨在為活動期結核病的臨床診斷提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年8月至2019年11月西安大興醫院收治的141 例結核病患者進行研究，141 例結核病患者最終確診活動期結核病患者97 例(活動期結核病組)，非活動期結核病患者44 例(非活動期結核病組)，另選擇同期在我院體檢的60 例健康志愿者作為對照組。納入標準：(1)活動期結核病組、非活動期結核病組患者均符合中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會發布的《肺結核診斷標準(WS288-2017)》[5]中關于活動性結核病和非活動性結核病的相關診斷標準；(2)對照組健康體檢者經胸部X線片、生化檢測、免疫學檢查證實身體健康，無結核病史和近期結核患者密切接觸史者。排除標準：(1)合并有心腦血管疾病，造血系統疾病以及肝、腎等重要臟器有嚴重器質性病變者；(2)有免疫抑制劑用藥史、放化療治療史者?；顒悠诮Y核病組中男性61 例，女性36例；年齡27～74歲，平均(47.38±6.19)歲；活動期肺結核61 例，活動期結核性胸膜36 例。非活動期結核病組中男性 28 例，女性 16 例；年齡 25～71 歲，平均(47.45±6.21)歲。對照組中男性37例，女性23例；年齡24～73歲，平均(47.41±6.33)歲。三組受檢者的性別、年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，患者家屬知情并同意簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血T-SPOT.TB 檢測及陽性判定 本研究的T-SPOT.TB 試劑盒購自上海復星高科技有限公司，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行：入院后，采集各組受檢者的5 mL 外周靜脈血置于真空肝素鈉抗凝管中，采用Ficoll 淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMCs)。在抗INF-γ抗體預包被的細胞計數板中加入AIM-V無血清培養液、B抗原濾液培養蛋白10(CFP10)、A 抗原早期分泌性靶抗原6(ESAT6)各50 μL，同時加入50 μL 細胞培養基作為空白對照，放置在37℃5%二氧化碳的培養箱中培養16～20 h。取出培養板中舍棄孔內液體，清洗干凈后在孔內加入50 μL新鮮酶標抗體溶液，于2℃～8℃下培養1 h，之后再加入50 μL 底物溶液，在室溫條件下顯色反應7 min，經蒸餾水清洗后進行干燥處理，采用ELISPOT自動計數儀進行斑點計數。

依據斑點計數確定檢測結果：陰性對照斑點數≤5 個，ESAT6 或 CFP10 斑點數-陰性對照斑點數＞7 個時，檢測結果為陰性；陰性對照斑點數＞5個，ESAT6或CFP10 斑點數-陰性對照斑點數≥陰性對照組斑點數的兩倍時，檢測結果為陽性。

1.2.2 38kD-IgG檢測及陽性判定 各組受試者在入院后采用真空肝素鈉抗凝管采集外周靜脈血5 mL，迅速混勻后在最短時間內采用玻璃棒剝離纖維蛋白，以確保血液標本無渾濁沉淀，以防止吸入堵塞反應膜孔。采用斑點免疫金滲濾試驗(DIGFA)原理檢測血清標本中的38kD-IgG，試劑盒購自濰坊市康華生物技術有限公司，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。該試劑中的結核分枝桿菌能夠捕獲血清中的含結核IgG抗體，與葡萄球菌A蛋白(SPA)結合形成特異性紅色斑點，若檢測結果出現紅色斑點，則判定為陽性，否則為陰性。

1.3 統計學方法 應用SPSS21.0 統計學軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗陽性率比較 活動期結核病組患者的T-SPOT.TB 陽性率和38kD-IgG陽性率分別為90.72%、74.23%，明顯高于非活動期結核病組的77.27%、54.55%和對照組的8.33%、6.67%，非活動期結核病組的T-SPOT.TB 陽性率和38kD-IgG陽性率明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗陽性率比較[例(%)]

2.2 T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗對活動期結核病的診斷效能比較 T-SPOT.TB試驗在診斷活動期結核病上的敏感度、特異度、準確度以及陽性預測值和陰性預測值明顯高于38kD-IgG試驗，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 活動期結核病組和非活動期結核病組患者的T-SPOT.TB 斑點計數比較 兩組患者的ESAT6 斑點計數比較差異無統計學意義(P＞0.05)；活動期結核病組患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑點計數明顯高于非活動期結核病組患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 T-SPOT.TB、38kD-IgG試驗診斷活動期結核病的效能比較(%)

表3 活動期結核病組和非活動期結核病組患者的T-SPOT.TB斑點計數比較

表3 活動期結核病組和非活動期結核病組患者的T-SPOT.TB斑點計數比較

例數88 34組別活動期結核病組非活動期結核病組t值P值ESAT6 24.33±6.29 22.92±6.71 1.090 0.278 CFP10 60.46±13.84 41.27±9.38 7.442 0.001 ESAT6合并CFP10 86.24±20.92 68.31±18.33 4.387 0.001

3 討論

結核分枝桿菌感染及嚴重程度與結核分枝桿菌的毒性、數量以及自身免疫等因素有關[6]。一般情況下，機體感染結核分枝桿菌后處于潛伏狀態，體內的結核分枝桿菌處于靜止狀態；機體免疫功能下降時，體內的結核分歧桿菌由靜止狀態轉變為活躍狀態，此時潛伏感染則轉變為活動期結核病[7-8]。早期診斷和治療對于減少和控制結核病的發展和傳播具有重要意義。

T-SPOT.TB 試驗、38kD-IgG 試驗作為近年來興起的結核病檢查手段，在臨床上應用廣泛[9]。本研究結果顯示，活動期結核病患者的T-SPOT.TB 陽性率和38kD-IgG 陽性率分別為90.72%、74.23%，均明顯高于非活動期結核病患者健康體檢者(分別為77.27%、54.55%和8.33%、6.67%)，非活動期結核病組的T-SPOT.TB 陽性率和38kD-IgG 陽性率均明顯高于健康體檢者。結果說明T-SPOT.TB試驗、38kD-IgG試驗在臨床診斷具有一定應用價值。

38kD-IgG 試驗通過檢測純化結核分枝桿菌胞壁蛋白38kD抗原檢測血液中相應的IgG抗體，進而能夠對體內是否存在結核分枝桿菌進行判斷[10]。由于38kD-IgG抗體是一種免疫顯性分泌蛋白，在其他分枝桿菌中也廣泛存在，交叉反應較高；另外，38kD-IgG抗體通常出現在結核病中晚期，早期檢測可能會出現假陰性[11]。因此在一定程度上限制了38kD-IgG 試驗在診斷活動期結核病中的應用。

結核感染T 細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)以γ-干擾素釋放試驗為基礎，通過檢測單細胞上的結核分枝桿菌判斷疾病[12]，其使用的ESAT6、CFP10二種特異性抗原主要集中在結核分枝桿菌復合群中，與絕大多數非結核分枝桿菌及卡介苗都沒有交叉反應[13-14]，因此具有較高的敏感性和特異性，且不受機體免疫狀態影響。本研究結果顯示，T-SPOT.TB 試驗在診斷活動期結核病上的敏感度、特異度、準確度以及陽性預測值和陰性預測值分別為90.72%、77.27%、86.52%、89.90%和79.07%，均明顯高于38kD-IgG 試驗的74.23%、54.55%、68.09%、78.26%和48.98%，與相關文獻報道相符。另外，在T-SPOT.TB 試驗中，每個斑點代表一個致敏的T 淋巴細胞，斑點數目的增加能夠在一定程度上代表結核病的活動程度[15-16]。本研究結果顯示，活動期結核病組患者的CFP10、ESAT6 合并CFP10 斑點計數均明顯高于非活動期結核病組患者。因此，通過觀察患者的斑點計數，能夠在一定程度上體現結核病患者的活動程度。

綜上所述，T-SPOT.TB 試驗在診斷活動期結核病上較38kD-IgG 試驗更加敏感、準確，對于排除非活動期結核病、減少不必要的抗結核治療具有重要意義。另外，結核病的活動性隨著T-SPOT.TB試驗斑點計數的增加而增加，因此T-SPOT.TB試驗在評估活動期結核病嚴重程度上也能夠發揮一定作用。