異氟醚對腦缺血再灌注大鼠側支循環形成及Notch通路的影響

張 敏，項明瓊，油文靜，伍 璀

(1.同濟大學附屬楊浦區中心醫院麻醉科，上海 200082 2.復旦大學附屬華山醫院北院麻醉科，上海 200082)

腦中風是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外，具有極高的病死率和致殘率，主要分為出血性腦中風(腦出血或蛛網膜下腔出血)和缺血性腦中風(腦梗塞、腦血栓形成)兩大類，以腦梗塞最為常見[1]。腦缺血/再灌注(I/R)損傷包括缺血期的原發性損傷和再灌注期間的繼發性損傷，可能形成腦水腫并加重由多種因素引起的腦損傷，包括細胞膜損傷，興奮性氨基酸毒性和中性粒細胞活化[2]。顱內側支循環在缺血性中風的發生、發展、治療和預后中起著極其重要的作用。研究表明，異氟醚常用于鎮靜和麻醉處理的缺氧缺血性腦病，并激活神經元的多核或抑制某些神經信號通路，異氟醚處理可以減少缺氧缺血性腦損傷，并起到類似于缺血預處理的作用[3]。Notch家族是多功能相互作用的細胞因子超家族，由30多種蛋白質組成。在細胞中，Notch家族成員涉及一系列由前體蛋白產生的生物學效應；Notch也通過兩種形式分泌到細胞外膜中[4]。Notch1信號轉導過程涉及I型受體的激活，Smad蛋白(Smad)、磷酸化的Smad蛋白和轉化生長因子-β(TGF-β)組合從Smad復雜易位到核調節mRNA下游信號蛋白的轉錄。血管內皮生長因子(VEGF)也是Notch1調控下的細胞因子[5]。本研究擬探討異氟醚對腦缺血再灌注大鼠側支循環形成及Notch通路的影響，為腦缺血再灌注的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑及儀器:異氟醚(美國sigma公司，批號M5474)；依達拉奉注射液(國藥集團國瑞藥業有限公司，規格30mg/支，批號20190813)；Trlzol試劑、cDNA合成試劑盒(杭州博日科技有限公司，批號BSC51M1、BSB09M1)；SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(寶日醫生物技術(北京)有限公司，批號DRR041A)；放射免疫沉淀分析裂解液(北京欣華綠源科技有限公司，批號SS0892；BCA蛋白測定試劑盒(美國Pierce公司，批號BI548854)；10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膜(碧云天生物技術研究所，批號EN545465)；聚偏二氟乙烯膜(美國賽默飛世公司，批號BT12654)；Notch1、VEGF、β-actin一抗(美國Abcam公司，批號ab46182、ab39973、ab00113)；辣根過氧化物酶標記的二抗(西化儀(北京)科技有限公司，批號BBY193)；增強的化學發光檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號HR0340-UHF)。WE098型病理包埋機、WS96病理切片機(德國徠卡公司)；CKX53型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；ABI7500型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；TZL-650WK型超聲破碎儀(蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司)；GelView 5000 Pro型凝膠成像分析系統(廣州博鷺騰生物科技有限公司)。

1.2實驗動物及分組:清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠90只，年齡8周；重量180～220g，不拘雌雄，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(云)2018-0012，動物質量合格證號：SC-19061209。本研究經同濟大學附屬楊浦區中心醫院倫理委員會批準。大鼠飼養環境：溫度22～24℃，濕度50～60%，光照12/12循環；適應性飼養1周。大鼠按隨機數字表法分成5組：對照組、模型組、依達拉奉組(3mg/kg)、異氟醚低劑量組(50μg/kg)、異氟醚高劑量組(100μg/kg)，每組18只。

1.3動物模型制備及給藥:模型組、依達拉奉組、異氟醚低、高劑量組腹腔注射戊巴比妥腹麻醉后，通過大腦中動脈阻塞(MCAO)方法誘發局灶性腦缺血-再灌注損傷。對照組的大鼠接受相同的手術程序，只是未阻塞頸動脈。依達拉奉組、異氟醚低、高劑量組造模成功后第1天開始分別腹腔注射3mg/kg的依達拉奉、50μg/kg的異氟醚、100μg/kg的異氟醚，(給藥體積均為10mL/kg)，每天1次，持續給予1周，對照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水(給藥體積10mL/kg)。

1.4大鼠腦缺血再灌注區域微血管密度及病理結果觀察:實驗結束后處死大鼠，獲取腦缺血再灌注區域組織，HE染色常規制作病理切片；計數鏡下微血管數目并觀察腦缺血再灌注區域病理改變。

1.5神經運動功能評分、雙側貼紙去除及平衡木過桿實驗:實驗結束后，以盲控方式記錄缺血性損傷后的每只大鼠的神經運動功能評分，采用以下評分制度：0分，未見任何神經功能缺失；1分，拿著尾巴提起老鼠前爪未能伸展；2分，行走時，身體右傾或向右旋轉；3分，行走時，身體向右側跌倒；4分，無法自發行走，或意識水平降低；得分越高表示神經運動功能越差。依據相關文獻對大鼠行雙側貼紙去除及平衡木過桿實驗[6]。

1.6大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達的測定:Trlzol試劑從腦缺血再灌注區域組織中分離總RNA，在提取總RNA后進行逆轉錄，使用逆轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA轉化為cDNA。在ABI7500型PCR儀上使用SYBR Premix Ex Taq實時熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR。引物由寶日醫生物技術(北京)有限公司合成。序列如下：Notch1上游(5'-CTGGAGCCAGCATGAATCCAG-3')和下游(5'-TTCTTCTCTTCTCCACGGTCA-3')；VEGF上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-TGGTCCCGGTTGTACAGTCCTAAT-3′)；β-actin上游(5'-AGAAATGGTGCCTGGACACCTCAT-3')和下游(5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGATC-3')。β-actin為內參基因。PCR總反應體系(20 μL)為：SYBR Premix Ex Taq 8 μL，cDNA模板 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，去離子水8 μL。熱循環參數為：97℃ 45s，56℃ 42s，73℃ 40s，70℃ 15min。每個樣品進行三次測量。2-△△Ct法用于計算Notch1、VEGF mRNA的相對表達水平。

1.7大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達的測定:將腦缺血再灌注區域組織通過超聲破碎儀壓碎，并與放射免疫沉淀分析裂解液混合。然后，使用BCA蛋白測定試劑盒確定相關蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并轉移至聚偏二氟乙烯膜。將含有蛋白質的膜在室溫下孵育2h，然后與Notch1、VEGF、β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)一起在4℃過夜孵育。然后，將膜用含Tween 20的Tris緩沖鹽水洗滌三次，并與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000稀釋)孵育，使用增強的化學發光檢測試劑盒進行顯影。使用凝膠成像分析系統進行掃描和分析蛋白質印跡帶。β-actin作為內參蛋白。

2 結 果

2.1各組大鼠腦缺血再灌注區域微血管密度比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區域微血管密度降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域微血管密度升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域微血管密度高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域微血管密度與依達拉奉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注區域微血管密度比較

2.2各組大鼠神經運動功能評分、雙側貼紙去除及平衡木過桿時間比較:與對照組比較，模型組神經運動功能評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間升高(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組神經運動功能評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間降低(P<0.05)；且異氟醚高劑量組神經運動功能評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間低于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組神經運動功能評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間與依達拉奉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠神經運動功能評分雙側貼紙去除及平衡木過桿時間比較

2.3各組大鼠腦缺血再灌注區域神經元結構的比較:對照組神經元細胞完整；模型組海馬區可見大量壞死神經元，神經細胞核固縮，有明顯炎癥細胞浸潤；依達拉奉組、異氟醚高劑量組神經元細胞結構較為完整，炎癥細胞浸潤減少；異氟醚低劑量組仍可見明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4各組大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達水平比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA表達與依達拉奉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1 VEGF mRNA表達水平比較

2.5各組大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達水平比較:與對照組比較，模型組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，依達拉奉組、異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達升高(P<0.05)；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達高于異氟醚低劑量組(P<0.05)；異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白表達與依達拉奉組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1 VEGF蛋白表達水平的比較

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注區域神經元結構病理圖(HE染色，200倍)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF蛋白印跡圖

3 討 論

異氟醚是臨床上廣泛使用的吸入麻醉藥之一，已證實異氟醚具有神經保護作用。現有研究表明低濃度的異氟醚預處理可以在較短的時間內為缺血性損傷提供保護[7]。研究發現異氟醚可抑制血小板聚集和粘附并減少炎癥；在中風后彌漫性腦腫脹的早期，高劑量的異氟醚可以增加微循環并改善總體預后，減少梗塞體積并激活神經營養因子分泌。本次研究顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域微血管密度高于模型組；這說明異氟醚能明顯促進腦缺血再灌注大鼠側支循環形成。此外對大鼠神經運動功能分析顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組神經運動功能評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間低于模型組；說明異氟醚對腦缺血再灌注大鼠神經運動功能具有恢復作用，側支循環是腦缺血再灌注的重要預后因素。研究表明，與沒有側支循環的患者相比，代償性側支循環良好的急性腦梗死患者灌注面積小，早期臨床癥狀明顯改善[8]。此外，側支循環有助于預測血管內治療的療效以及最終的梗塞面積和出血性轉化的風險。這些研究均與本研究結果一致。此外，病理學結果顯示，依達拉奉組、異氟醚高劑量組神經元細胞結構較為完整，炎癥細胞浸潤減少；異氟醚低劑量組仍可見明顯炎癥細胞浸潤，說明異氟醚能減輕腦缺血再灌注大鼠缺血梗死灶炎癥反應。

Notch1在神經干細胞中高度表達，并調節神經發育和樹突形態，Notch1信號通路在體內和體外缺血后均被激活，具有神經修復功能。研究表明，Notch1的激活可以促進缺血性中風后神經細胞的增殖和分化。此外，Notch信號傳導促進中風后巨噬細胞的活化和樹突狀細胞的分化。Notch信號傳導有助于維持核因子κB(NF-κB)活化，并增強炎癥反應，Notch1可在局灶性腦缺血后激活小膠質細胞，能夠介導炎癥，清除受損的神經元并修復缺血后的損傷[9]。研究表明，Notch1的非典型信號傳導途徑激活了非Smad依賴性的轉導途徑，從而改變了細胞的生物學特性，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途徑是非Smad依賴性途徑[10]。作為MAPK信號通路的成員VEGF是細胞增殖和凋亡調控的關鍵途徑，VEGF通路是血管生成的重要途徑[11]。本次研究顯示，異氟醚低劑量組、異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達高于模型組；且異氟醚高劑量組腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達高于異氟醚低劑量組。這與上述討論一致，同時說明異氟醚可促進大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白表達水平的表達進而激活Notch信號通路。綜上所述，異氟醚能明顯促進腦缺血再灌注大鼠側支循環形成；其機制可能與異氟醚可促進大鼠腦缺血再灌注區域組織Notch1、VEGF mRNA和蛋白的表達進而激活Notch信號通路有關。