基于共表達網絡分析的Ⅰ期胃癌預后基因篩選

禮想，楊博文，宮麗寶，臧丹，張朝旭，張闖，李智，曲秀娟

（中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，遼寧省腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，也是全球癌癥死亡的第三大原因［1］。胃癌患者的生存時間主要與確診時分期密切相關，確診時分期越早，生存時間越長，甚至可以治愈。既往研究［2］已確定了包括人類表皮生長因子受體2 （human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、糖類抗原19-9 （carbohydrate antigen 19-9，CA19-9） 和血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 等多種胃癌生物標志物，其中某些可用于臨床判斷預后、預測療效或作為診斷的生物標志物。找到能夠準確預測Ⅰ期胃癌預后的新型分子生物標志物，將有助于進一步研究Ⅰ期胃癌的發病機制及進行個性化治療。

加權基因共表達網絡分析 （weighted correlation network analysis，WGCNA） 是一種聯合分析臨床信息和基因表達數據的方法。通過分析與臨床信息相關性高的基因模塊，獲得一系列在模塊中具有高連接度的關鍵基因，這些基因對腫瘤的發生發展具有潛在的重要作用［3-4］。癌癥基因組圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 是由美國 National Cancer Institute（NCI） 和National Human Genome Research Institute（NHGRI） 共同開發的數據庫網站，包含有30余種癌癥的數據信息。研究人員已利用WGCNA 及TCGA發現了多種癌癥的分子機制和特征。本研究擬利用胃癌的TCGA數據，構建基因共表達網絡，識別網絡中與胃癌預后相關的模塊和基因，并對預后基因進行體外實驗和通路富集，對該分子可能影響胃癌患者預后的機制進行分析和探討。

1 材料與方法

1.1 數據獲取與篩選

從TCGA數 據 庫 （https：//www.cancer.gov/aboutnci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中下載胃癌患者的基因表達譜數據和臨床數據。納入研究的臨床病例應包括病理性TNM分期、組織學等級、生存信息。排除病理分期或組織學分級信息不完整的病例。

1.2 構建基因共表達網絡

利用WGCNA對Ⅰ期胃癌數據進行分析。通過中位數絕對偏差 （median absolute deviation，MAD） 測量基因變異性，并按MAD進行排序，獲取前3 600個基因。使用R包進行 WGCNA 分析，加權鄰接矩陣定義如下：Amn=|Smn|β。其中，Smn為基因m和基因n之間的Pearson相關性；Amn為基因m和基因n之間的鄰接。

在WGCNA中，需要選擇合適的軟閾值β才能構建網絡。最佳軟閾值需達到無尺度擬合指數 0.9 以上，且需要網絡的平均連通性較高。以此軟閾值構建拓撲重疊矩陣 （topological overlap matrix，TOM）。WGCNA將具有高拓撲重疊指數的一組基因定義為同一模塊，進行層次聚類，建立有嵌套的分層聚類樹。基于WGCNA的R軟件包中的MEs （module eigengenes） 函數，計算其差異性。通過Cytoscape軟件（v3.4.0） 可將模塊的共表達網絡可視化。

1.3 篩選樞紐基因

為了確定與Ⅰ期胃癌臨床信息有關的模塊，通過Pearson相關性檢驗計算出MEs與臨床特征之間的相關性，P＜ 0.05被認為有統計學意義。測量每個模塊的基因顯著性 （gene significance，GS），即基因與性狀之間的相關性。模塊的GS絕對值越高，表示該模塊的生物學意義越強。通常，模塊的GS傾向于與模塊特征基因和臨床特征之間高度相關。傾向于具有高模塊成員 （module membership，MM） 定量值的高度連接的模塊內基因被定義為樞紐基因，它在功能上具有重要作用。為了鑒定樞紐基因，使用Cytoscape軟件 （v3.4.0） 中內置的cytoHubba進行網絡分析。在Cytoscape軟件中顯示了前25個樞紐基因。為了驗證樞紐基因的臨床意義，依據基因表達量將胃癌患者分為低表達和高表達2組。通過生存分析確認影響胃癌預后的基因。此外，通過Kaplan-Meier在線數據分析 （http：//www.kmplot.com） 進一步評估該基因對胃癌患者的生存的影響。

1.4 體外細胞學實驗

1.4.1 實時定量PCR：在4種胃癌細胞系 （MKN-45，BGC-823，SGC-7901，MGC-803） 中檢測腦酸可溶性蛋 白1 （brain acid soluble protein 1，BASP1） 基 因 的mRNA表達。用Trizol試劑盒 （美國Invitrogen公司） 從培養的胃癌細胞中提取RNA，并測量其RNA濃度。用PrimeScript RT試劑盒 （日本TaKaRa公司） 進行逆轉錄。用SYBR premixed explosion-proof TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus，日本TaKaRa公司） 進行實時PCR，并在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems （美國Thermo Fisher公司） 中檢測mRNA表達量。18S用作內部對照。PCR條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s、58 ℃34 s，45個循環。采用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。PCR引物序列如下，BASP1F，5’-GCAAC TCGTTTGCAGCG-3’，R，5’-TGCCTCCCATCTTGG AGTTC-3’；18S F，5’-CCCGGGGAGGTAGTGACGA AAAAT-3’，R，5’-CGCCCGCCCGCTCCCAAG AT-3’。

1.4.2 MTT法檢測腫瘤細胞增殖：將轉染BASP1siRNA和NC siRNA的MGC803細胞懸浮液以4 000/孔的密接度種于96孔板內，孵育72 h。加入MTT溶液 （5 mg/mL，20 μL/孔） 混勻，37 ℃靜置4 h后，棄上清液，加入二甲基亞砜 （200 μL/孔） 溶解結晶，于波長570 nm處酶標儀 （Model 550，美國Bio-Rad公司） 測量光密度 （optical density，OD） 值。每組設置4個復孔，實驗重復3次。

1.4.3 細胞遷移能力檢測：在24孔小室 （8 μm，美國Corning公司） 中進行遷移測定。用200 μL無血清RPMI1640培養基將預處理的對照組或轉染siRNA的細胞 （5×104/孔） 制備成細胞懸液。將混勻的細胞懸浮液接種于上室中，下室則包含500 μL RPMI1640培養基和2.5%胎牛血清。37 ℃孵育24 h后，取出小室，用濕棉簽將未遷移的細胞輕輕擦去，用Giemsa-Wright法染色培養皿下表面的細胞。在20倍顯微鏡下 （BX53，日本Olympus公司） 隨機選擇5個視野，計數遷移細胞的數量。

1.5 基因集富集分析 （gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA用于鑒定在預后因子高表達組中顯著富集的途徑。采用GSEA 3.0版本進行分析。用R中的Cluster Profiler程序包對該探索模塊中基因的潛在生物學機制和途徑進行探索。選擇GSEA網站的分子特征數據庫 （Molecular Signatures Database，MSigDB）中的c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt數據集作為參考基因集，以評估不同表達對每個參考集的影響。GSEA采用默認的加權富集統計方法進行，隨機組合的數量設計為1 000次。

1.6 統計學分析

采用R軟件 （version 3.6.1，www.r-project.org） 進行統計分析，構建生存曲線，并通過Kaplan-Meier Plotter在線驗證。正態分布變量使用獨立的t檢驗，其他變量進行Mann-WhitneyU檢驗。所有統計檢驗均為雙側檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數據處理

TCGA數據集中共納入臨床信息完整的胃癌病例330例，其中Ⅰ期胃癌51例，均為病理確診，平均總生存時間為18.49個月。包括男性患者16例 （31%）和女性患者35例 （69%）。見表1。

2.2 構建基因共表達網絡

應用51例具有完整信息的Ⅰ期胃癌數據構建基因共表達網絡。當軟閾值功率β值=5時，基因之間的連通性滿足無標度網絡分布，見圖1A。通過層次聚類和動態分支切割識別出42個模塊，為每個模塊分配了唯一的顏色作為標識符，見圖1B。

2.3 確定樞紐基因

表1 本研究中51例樣本的臨床信息Tab.1 Clinical information of the 51 samples in this study

將模塊和臨床特征進行關聯分析，尋找和臨床特征顯著相關的模塊，見圖2。考慮Ⅰ期胃癌患者T、N分期較早，選擇可能與胃癌預后相關性較大的組織學分化 （Grade） 臨床特征進行進一步研究，該臨床特征與Black模塊相關性最高，相關性系數cor=0.51，P＜ 0.05。

模塊中高度相關的樞紐基因具有至關重要的作用。在黑色模塊中篩選了前25個基因為樞紐基因，并進一步分析其內部相關性，其相互關系網絡見圖3A。通過對前25個樞紐基因逐個進行生存分析，獲得了影響胃癌預后的基因BASP1。TCGA生存分析結果表明，BASP1基因高表達患者的總生存期（overall survival，OS）明顯低于低表達患者 （P=0.016 25），見圖3B。利用Kaplan-Meier 曲線對BASP1基因進行生存分析，Kaplan-Meier在線分析也獲得了相似的結果，即高表達的患者的OS明顯短于低表達患者（27.4個月vs 47.7個月，P=0.000 51），見圖3C。表明BASP1可能是胃癌預后不良的預測指標。

2.4 BASP1基因的功能

圖1 基因共表達網絡構建Fig.1 Construction of gene co-expression networks

為了探索BASP1在胃癌細胞中的功能，用實時定量PCR檢測了BASP1在不同胃癌細胞系中的mRNA表達。如圖4A所示，在胃癌細胞系MGC-803中，BASP1表達最高，因此選擇該細胞株用于后續的細胞學實驗。為了探討BASP1的作用，利用siRNA敲低MGC-803細胞株中BASP1的表達。如圖4B所示，siRNA1敲減效果較好。TCGA數據庫及Kaplan-Meier在線數據分析發現，BASP1是胃癌的預后不良因子，因此，對BASP1的作用進行了進一步體外細胞學實驗研究。MTT分析結果如圖4C所示，抑制BASP1表達不會影響細胞增殖能力 （P=0.17）。但是，Transwell分析表明，與對照組相比，敲減BASP1表達后，胃癌細胞的遷移能力下降了62.2% （圖4D）。以上結果表明BASP1可能通過促進胃癌細胞遷移導致預后不良。

2.5 GSEA通路富集

為了探討BASP1基因抑制細胞遷移的機制，進行了GSEA富集分析。結果顯示，代表性腫瘤相關途徑IL6-JAK-STAT3信號傳導途徑的富集結果較好（NOMp-val＜ 0.001；FDRq-val＜ 0.001），見表2。

3 討論

胃癌生物學行為和分子機制的深入研究對準確預測胃癌的預后和療效、篩選新的胃癌生物標志物具有重要意義。本研究通過WGCNA分析了TCGA數據庫中Ⅰ期胃癌的數據，并從中篩選得到了預后影響因子BASP1。后續的生存分析結果顯示，雖然BASP1篩選自Ⅰ期胃癌患者，但其高表達的胃癌患者，無論分期如何，預后都較差。這表明盡管TNM分期的不同可對胃癌的預后產生影響，但是其內在的分子機制和生物學行為才是影響胃癌預后的根本因素。

圖2 評估模塊與臨床特征的關聯性Fig.2 Evaluate the correlations between MEs and clinical traits

圖3 BASP1高表達的胃癌患者預后差Fig.3 Overexpression of BASP1 confers a poor prognosis in gastric cancer

圖4 BASP1基因的功能Fig.4 The role of the hub gene BASP1

表2 GSEA中BASP1通路富集結果Tab.2 Pathway enrichment of BASP1 in GSEA

BASP1 （也稱CAP-23，NAP-22） 是一種從腦細胞質中提取的氨基末端十四烷酰化蛋白，主要表達于細胞質和細胞核中。既往文獻［5-6］報道，BASP1大量表達于神經末梢中，睪丸、淋巴器官和腎臟等中也有表達。BASP1最重要的生物學功能是通過調節細胞骨架相關蛋白的運動，促進軸突的生長和發育。已有BASP1與癌癥有關的相關報道［7-8］，但關于它在癌癥中作用的研究很少。

BASP1過表達對不同癌癥患者生存的影響有所不同。BASP1在乳腺癌［8］、黑色素瘤［9］、甲狀腺癌［10］、肝細胞癌［11］和胰腺癌［12］中表達下調時，預后較差。相反，BASP1高表達與子宮頸癌患者的整體生存能力差有關［13］。迄今為止，尚未見BASP1與胃癌預后有關的報道。本研究結果表明，BASP1可能是胃癌預后不良因子。

關于BASP1的作用機制，研究發現，乳腺癌中BASP1與雌激素受體α有相互作用［8］；宮頸癌中，BASP1可能通過調節細胞周期和增殖發揮作用［13］；甲狀腺癌中，BASP1可能影響細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和遷移［10］。本研究結果顯示，敲減BASP1后，胃癌細胞增殖能力未見明顯變化，而遷移能力明顯減弱。說明BASP1下調可改變胃癌細胞的遷移能力，提示BASP1主要通過影響胃癌細胞的遷移來影響胃癌的預后，與以往的研究結果不同。BASP1的富集分析結果顯示，IL6-JAK-STAT3通路與胃癌相關。

白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6） 是由IL-6基因產生的一種細胞因子。IL-6與其受體結合，通過JAK/STAT途徑激活STAT3分子，刺激下游基因表達以執行多種生理功能［14］。文獻［15-26］報道，在頭頸部腫瘤、食道癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、結直腸癌、胰腺癌、腎癌、前列腺癌及非小細胞肺癌患者中，均可觀察到循環水平的IL-6升高。STAT3是STATs家族中重要的成員之一，其活化形式主要是通過酪氨酸磷酸化［27］。研究［28-32］發現，在鼻咽癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中均可檢測到STAT3的異常活化。另有研究［33］發現，外源IL-6能促進胃癌的增殖、侵襲和轉移，其潛在機制可能與JAK-STAT3-VEGF-C信號通路有關。BASP1在細胞核中表達豐富，因此推測它可能通過影響細胞核中IL-6分泌并調節IL6-JAK-STAT3途徑，促進胃癌細胞遷移，具體機制仍有待進一步驗證。

綜上所述，BASP1是胃癌預后不良因子。BASP1可能通過影響IL6-JAK-STAT3通路，促進胃癌轉移，從而導致胃癌預后不良。