CD14啟動子-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族2型糖尿病足患者足背動脈硬化相關性研究

Amit Sinha 金香子 于婕 鄭壽煥 金光明

[摘要] 目的 研究CD14基因-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族2型糖尿病足患者（DF）足背動脈硬化（FDA）的關聯(lián)性。 方法 選取2018年10月至2020年5月在延邊大學附屬醫(yī)院內分泌科及手足外科住院的朝鮮族DF患者286例，彩色多普勒超聲觀察患者FDA情況，將存在FDA的患者分為無潰瘍組（NFDAU組）和有潰瘍組（FDAU組），記錄全部2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血液生化指標。同時，應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性技術對所有DF患者的CD14基因-159位點進行基因型分析。 結果 無潰瘍組和有潰瘍組CD14基因-159位點上，各基因型及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.801，P>0.05;χ2=1.864，P>0.05）;CC基因與CT及TT基因基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=0.009，P<0.05）;NFDAU組和FDAU組在病程、吸煙飲酒、高血糖及高尿酸指標方面比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Logistic回歸分析顯示，病程、吸煙飲酒及C等位基因均與FDAU相關聯(lián)（P<0.05）。 結論 CD14基因-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族DF并發(fā)FDA相關，其中CC純合子基因是DF患者并發(fā)FDAU的遺傳學風險因素。病程、吸煙、飲酒及C等位基因是FDAU的危險因素。

[關鍵詞] CD14基因-159位點;基因多態(tài)性;2型糖尿病足;足背動脈硬化;潰瘍;彩色多普勒超聲

[中圖分類號] R575.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）33-0006-05

[Abstract] Objective To study the association between gene polymorphism of -159 locus in CD14 gene promoter and foot dorsal arteriosclerosis （FDA） in Chinese Korean type 2 diabetic foot patients （DF）. Methods A total of 286 Korean DF patients hospitalized in the Department of Endocrinology and Department of Hand and Foot Surgery in Yanbian University Hospital from October 2018 to May 2020 were selected. The FDA status of the patients was observed using color Doppler ultrasound. The patients with FDA were classified as the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU）. All biochemical blood indicators of type 2 diabetic mellitus （T2DM） patients were recorded. At the same time， the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique was used to perform genotype analysis on the-159 locus of CD14 gene in all DF patients. Results There was no statistically significant difference in the genotypes and allele frequencies at-159 locus of CD14 gene between the non-ulcer group（NFDAU） and the ulcer group （FDAU） （χ2=1.801， P>0.05; χ2=1.864， P>0.05）. The gene frequency difference between CC， CT and TT genes was statistically significant （χ2=0.009， P<0.05）.There were significant differences in disease course， smoking and drinking， hyperglycemia，and hyperuric acid indicators between NFDAU and FDAU（P<0.05）.Logistic regression analysis showed that the course of disease， smoking and drinking， and C allele were all associated with FDAU（P<0.05）. Conclusion The polymorphism of 159 locus of CD14 gene is associated with FDA in Chinese Koreans with DF. The CC homozygous gene is a genetic risk factor for DF patients with FDAU. The course of disease， smoking， drinking and C allele are risk factors for FDAU.

[Key words] 159 Locus in CD14 gene; Gene polymorphism; Type 2 diabetic foot; Foot dorsal arteriosclerosis; Ulcer; Color Doppler ultrasound

糖尿病足（Diabetic feet，DF）是糖尿病所有并發(fā)癥中最為嚴重、兇險的類型，可引起患者截肢、殘疾，重者可導致下肢壞疽、感染、甚至病死。DF包括以下兩個階段，即糖尿病周圍神經病變（Diabetic peripheral neuropathy，DPN）及足背動脈硬化（Foot dorsal arteriosclerosis，F(xiàn)DA），兩者相互關聯(lián)、互相演進，直接導致患者生存質量嚴重下降，并威脅患者生命。然而，目前臨床對其尚缺乏有效的治療手段。因此，越來越多的觀點認為在DF發(fā)病前采取早期干預和治療意義重大[1]。多年來，本課題組一直從事CD14基因-159位點基因多態(tài)性與2型糖尿病（Type 2 diabetic mellitus，T2DM）患者血管病變相關性的研究，本研究發(fā)現(xiàn)該基因多態(tài)性與T2DM患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成、左心室肥厚密切相關，且-159位點的基因突變可引起T2DM患者微血管血流動力學發(fā)生變化，最終導致視網膜中央動脈、腎動脈發(fā)生一系列病變[2-4]，但目前國際和國內關于其與足背動脈硬化關聯(lián)的研究較少，這也為本研究提供了進一步研究的空間和思路。

邊疆少數(shù)民族人民的身體健康一直是黨和國家關心的重要問題，在地域和風俗因素影響下，朝鮮族人民具有喜飲酒、喜高鹽飲食等習慣，而以上均被認為是糖尿病血管并發(fā)癥的危險因素。為此，筆者進行了本研究，旨在為邊疆地區(qū)朝鮮族DF患者提供一些發(fā)病危險因素及臨床預警信息，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至2020年5月在我院內分泌科及手足外科住院的朝鮮族DF患者286例，所有患者均為T2DM患者，T2DM診斷根據(jù)2019年WHO公布的最新診斷標準[5]。并排除具有如下任一種情況者：繼發(fā)性高血壓、冠心病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及因藥物導致的肝腎功能異常。其中男168例，女118例，平均年齡（54.23±9.68）歲。需要指出的是，本研究意在從早期對DF患者進行預防，因此篩選的患者只包含Wagner分級[6]中的0～3級患者，嚴重的合并周圍神經病變的患者未納入其中。所采用糖尿病足的診斷標準：①符合糖尿病診斷;②具有下肢缺血的臨床表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為下肢皮溫下降、皮膚蒼白、伴有麻木酸痛感及出現(xiàn)間歇性跛行癥狀;③彩色多普勒超聲檢測出現(xiàn)足背動脈斑塊形成、管腔狹窄甚至閉塞。最終篩選出FDA患者244例，其中無潰瘍組（Non-foot dorsal arteriosclerosis ulcer，NFDAU）患者184例，有潰瘍組（Foot dorsal arteriosclerosis ulcer，F(xiàn)DAU）患者60例。本研究經延邊大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有參加研究的患者均簽署知情同意書并知曉研究內容。

1.2 方法

1.2.1 臨床指標? 所有患者年齡、性別、吸煙及飲酒等自然信息，根據(jù)WHO的標準化建議，吸煙人群的定義標準為“每周吸煙>4次，總量≥6支”;飲酒人群的定義標準為“平均攝入酒精量>30 g/d，持續(xù)時間≥半年”[7]。測量血壓、病程、身體質量指數(shù)（Body mass index，BMI），抽取肘靜脈血進行生化檢測，項目含空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、三酰甘油（Triglyceddes，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、C-反應蛋白（C reactive protein，CRP）、糖化血紅蛋白（Glycatized hemoglobin，HbAlc）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、尿酸（Uric acid，UA）等。

1.2.2 彩色多普勒超聲檢查足背動脈? 患者行彩色多普勒超聲檢查前禁煙及禁酒48 h，采用坐位檢查，使用東芝S2000彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭頻率為5～7.5 MHz，觸及足背動脈搏動感時，將探頭沿血管走行縱切探查，不要用力壓迫血管，測量足背動脈內中膜厚度（Intima-media thickness，IMT），當IMT≥1 mm時可診斷為DFA[8]。

1.3 患者DNA的提取

根據(jù)WizardR Genomic DNA Purification Kit （Pro-mega公司）說明書步驟提取DNA。上游引物為：5-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物為：5-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。擴增完成后，以Ava Ⅱ限制性內切酶對擴增產物進行酶切反應，之后進行電泳，在2%瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)基因條帶后進行基因型的判讀，記錄所有患者基因型。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，評估等位基因及基因頻率利用χ2檢驗。Logistic回歸分析評價各風險因素及C、T等位基因突變與FDAU的相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 彩色多普勒超聲檢查FDA聲像圖

根據(jù)彩超聲像圖（圖1A）中，可見足背動脈前壁上多個強回聲斑塊形成，但動脈管腔未見狹窄，血流通暢;圖1B可見足背動脈后壁上弱回聲斑塊形成，造成此處動脈管腔狹窄，血流束變細;圖1C可見足背內部充滿弱回聲，管腔內未見血流信號，提示足背動脈閉塞。

2.2 CD14基因-159位點基基因型測序

經檢驗，CD14基因-159位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，等位基因頻率在不同種族人群中的分布亦符合Hardy-Weinberg平衡定律。見圖2。

2.3 CD14基因-159位點基因型

CD14 PCR擴增產物經酶切后基因型有3種，CC型（497 bp），CT型（497、353、l44 bp），TT型（353、144 bp）。見圖3。

2.4 NFDAU組和FDAU組CD14基因-159位點基因型和等位基因頻率比較

根據(jù)彩超結果及肉眼觀察患者足背表皮情況，將DF患者分為有潰瘍組（FDAU組）和無潰瘍組（NFDAU組）。CD14基因-159位點基因多態(tài)性在朝鮮族正常對照組和朝鮮族DN患者中的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.801，P>0.05）;等位基因頻率在兩組人群中的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.864，P>0.05）。見表1。

2.5 NFDAU組和FDAU組CD14基因-159位點CT+TT基因型和CC基因頻率比較

將CD14-159位點CC純合子與CT雜合子+TT純合子基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=0.009，P<0.05）。見表2。

2.6 自然信息與臨床生化指標的比較

FDAU組與NFDAU組年齡、吸煙、飲酒、病程、FBG、HbAlc和CRP比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其余各項比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.7 FDAU危險因素的Logistic回歸分析

將FDA患者視為一個隊列人群，以發(fā)生FDAU與否為因變量，將所有臨床資料和生化指標以及是否存在C-1591T突變?yōu)樽宰兞浚M行Logistic回歸分析。病程、吸煙和飲酒是FDAU的獨立危險因素，而C等位基因突變是FDAU的風險因素，存在C突變的DF患者合并FDAU風險增高。見表4。

3 討論

襲龍祥等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，約1/6的T2DM患者最終會發(fā)生DF，DF發(fā)病的典型“三聯(lián)征”包括神經異常、動脈異常及肌肉攣縮，而三者中最主要的病因就是足背動脈硬化（FDA）引發(fā)的動脈管腔狹窄及堵塞，導致足部局部組織缺血缺氧，出現(xiàn)炎癥反應，一旦發(fā)生感染，后果極為嚴重，甚至會發(fā)展成為壞疽[10-11]。

T2DM患者一般首先出現(xiàn)雙下肢深動脈及淺動脈血管的缺血性病變，當病變發(fā)展到一定程度時，則會累及足部，發(fā)生缺血性潰瘍，即糖尿病足潰瘍（FDAU），由于足部動脈位于人體供血末端，因此具有反復發(fā)作、難以愈合、遷延不愈等特點。本課題組前期研究顯示，CD14基因-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族T2DM患者下肢動脈硬化相關，其機制主要有以下幾點：CD14主要表達在單核巨噬細胞表面，通過刺激單核-巨噬細胞系統(tǒng)（Mononuclearphagocyte system，MPS）釋放多種炎癥細胞因子，加速蛋白質糖化產物的形成，并導致其在血管內堆積，引起血管平滑肌細胞增生和內中膜增厚;其次通過合成膠原蛋白Ⅲ[12]或直接作用于管壁細胞，增加血管細胞外基質，引起纖維組織增生及鈣質沉著，使內中膜增厚、血栓形成，最終導致動脈硬化及硬化斑塊的形成[13]，而足背動脈是下肢動脈在足部的延續(xù)，因此該基因多態(tài)性與DFAU的關系不難理解。

國內一些學者發(fā)現(xiàn)，感覺神經肽物質（Substance P，SP）和血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）與FDAU的發(fā)生呈負相關[14]。Park等[15]利用SP對糖尿病大鼠FDAU模型進行治療后發(fā)現(xiàn)，潰瘍面的愈合效果有明顯提升。而本研究的CD14基因-159位點C-T的基因突變過程中，引起組氨酸轉變?yōu)槔野彼岬淖兓?，此過程會導致SP和VEGF表達大幅降低，最終可導致潰瘍面的愈合不良，因此反向證明此基因突變與FDAU的關系。

研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（Nitricoxide，NO）在整個炎癥潰瘍的發(fā)生、發(fā)展及修復過程中，均發(fā)揮著重要作用[16]。CD14基因-159位點基因突變后會降低氧化酶的活性，導致動脈血管細胞的凋亡、一氧化氮（NO）的合成減少及各種炎癥因子大量釋放[17]，而FDAU究其根本是一種炎癥反應，因此兩者之間必然存在著較為密切的關聯(lián)性。

有關年齡、病程、FBG和HbAlc與FDAU存在相關性的機制比較容易理解，T2DM病程長者，其難以控制的高血糖及糖代謝紊亂會導致晚期糖基化終末產物（Advancd glyca-sylation end products，AGEs）在血管中大量蓄積，可引起皮膚、皮下組織及血管的多種損害;另外，持續(xù)的高糖狀態(tài)為細菌提供了在皮膚創(chuàng)面大量滋生、繁殖的溫床，以上均可引起局部的感染破潰、甚至壞疽[18]。

除了病理生理方面的原因，種族文化、生存地域、生活習慣的不同也越來越被認為是T2DM發(fā)病的重要病因，我國的朝鮮族主要聚集在我國東北部，民俗開朗、能歌善舞，有著悠久的飲酒傳統(tǒng)，甚至形成了一種“飲酒文化”。朝鮮族的飲酒文化可以說是深入到百姓的日常生活當中，是朝鮮族在適應東北地區(qū)寒冷生態(tài)環(huán)境，克服困難，憧憬美好生活的一種樂觀精神的反映。曾有調查研究顯示，朝鮮族人均每日酒精攝入量達到70～80 g，遠遠高于國際上推薦的不超過30 g的標準。酒類中D-氨基酸（D-amino acids，DAA）代謝會導致尿酸大量生成，高尿酸血癥可引發(fā)炎癥遞質釋放、動脈脂質過氧化而引起動脈硬化[19]。此外，朝鮮族在飲酒時，喜歡佐食高鹽、高糖食物，因而DF的發(fā)病風險明顯上升。煙草中的尼古丁、焦油吸收到人體后，其產生的氧自由基等物質進入血管可導致血管壁彈性下降，最終導致動脈硬化及DF等疾病的發(fā)生[20-21]。

綜上所述，筆者認為CD14基因-159位點基因多態(tài)性與中國朝鮮族FDAU患者存在相關性，其純合子CC基因性可能是FDAU獨立的危險因素。年齡、病程、FBG、CRP和HbA1c均可被視為FDAU發(fā)病的危險因素。希望通過本研究可指導糖尿病患者早期預防DF的發(fā)生，并為患者從基因水平篩查DF提供更好的依據(jù)。

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（收稿日期：2021-03-17）