LncRNA OCPAT1通過調控miR-320d/YOD1信號通路促進卵巢癌的發生及發展

黃曄 賴蔚菁 黃如 劉佳華

[摘要] 目的 研究lncRNA OCPAT1調控miR-320d/YOD1信號通路在卵巢癌發生發展中的作用及機制。 方法 2019年1月至2020年12月應用TCGA和GTEX數據庫篩選，通過qRT-PCR檢測確認lncRNA AC007405.3（OCPAT1）在卵巢癌組織和細胞中的表達;在ES-2細胞中敲減OCPAT1，通過實驗驗證，OCPAT1與miR-320d/YOD1的靶向調控關系。 結果 通過GTEX和TCGA數據庫及qRT-PCR檢測，確認OCPAT1高表達;敲低OCPAT1后，MTT增殖顯示敲減后細胞增殖減低，EdU細胞增殖顯示，敲減后處于復制期的細胞減少，流式細胞周期顯示敲減后細胞停滯在G0/G1期，流式周期顯示敲減后細胞凋亡增加，Transwell migration實驗顯示，敲減后抑制卵巢癌細胞ES-2的遷移能力，Matrigel invasion 實驗顯示敲減后抑制卵巢癌細胞ES-2的侵襲能力。雙熒光素酶報告基因實驗證實，OCPAT1可以靶向作用于miR-320d。 結論 lncRNA OCPAT1可能通過靶向調控miR-320d/YOD1信號通路調控卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲，進而促進卵巢癌的發生及發展。

[關鍵詞] LncRNA OCPAT1;miR-320d/YOD1信號通路;卵巢癌;增殖;遷移;侵襲

[中圖分類號] R737.31? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）33-0041-04

[Abstract] Objective To study the role and mechanism of lncRNA OCPAT1 in regulating the miR-320d/YOD1 signaling pathway in the development and progression of ovarian cancer. Methods From January 2019 to December 2020， the expression of lncRNA AC007405.3 （OCPAT1） in ovarian cancer tissues and cells was confirmed by RT-qPCR using TCGA and GTEX databases screening. OCPAT1 was knocked out in ES-2 cells， and the targeted regulatory relationship between OCPAT1 and miR-320d/YOD1 was verified by experiments. Results High expression of OCPAT1 was confirmed by GTEX and TCGA databases and RT-qPCR detection. After OCPAT1 knockdown， MTT proliferation showed decreased cell proliferation after knockdown. the EdU cell proliferation showed decreased cells in the replication phase after knockdown. flow cytometry cycle showed that cells stagnated in the G0/G1 phase after knockdown; flow cytometry cycle showed increased cell apoptosis after knockdown. The Transwell migration experiment showed that knockout inhibited the migration ability of ovarian cancer cell ES-2， and the Matrigel invasion experiment showed that knockout inhibited the invasion ability of ovarian cancer cell ES-2. Dual luciferase reporter assay confirmed that OCPAT1 could target miR-320d. Conclusion LncRNA OCPAT1 may regulate the proliferation， metastasis and invasion of ovarian cancer cells through the targeted regulation of the mir-320s/YOD1 signaling pathway， thus promoting the occurrence and development of the ovarian cancer.

[Key words] LncRNA OCPAT1; miR-320d/YOD1 signaling pathway; Ovarian cancer; Proliferation; Metastasis; Invasion

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一[1]，發病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌，居第3位，死亡率卻居女性生殖細胞腫瘤的首位[2]。臨床上急需卵巢癌早期的腫瘤標志物用于篩查，有利于為卵巢癌的治療提供理論依據[3]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）對卵巢癌的發生和發展起重要的作用，有望為卵巢癌的治療提供新思路[4]。研究表明，lncRNA AC007405.3在腫瘤細胞高表達，lncRNA AC007405.3可成為卵巢癌診斷的指標，及早期篩查。本研究將該lncRNA命名為卵巢癌進展相關轉錄本1（OCPAT1）。熒光原位雜交技術（FISH）實驗顯示，OCPAT1主要定位在細胞質，目前挑選miR-320d作為OCPAT1潛在的靶向微小RNA（miRNA）， 同時miR-320d靶向YOD1。本研究通過體外培養卵巢癌ES-2細胞探討lncRNA OCPAT1/miR-320d/YOD1軸在卵巢癌發生和發展中的作用，為靶向治療卵巢癌提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

卵巢癌細胞株與正常卵巢上皮細胞株IOSE-80均購自中科院上海生科院細胞庫。miR-320d mimic、miR-320d抑制物及其各自陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司;胎牛血清（FBS）購自美國 Invitrogen公司;lncRNA OCPAT1 siRNA 及其陰性對照均購自美國 Dharmacon公司;DMEM培養基購自美國Gibco公司;Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司;Matrigel購自上海偉進生物科技有限公司;Lipofectamine2000轉染試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;MTT檢測試劑盒購自上海東仁化學科技公司;逆轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）試劑盒均購自VAZYME公司;熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報告載體均購自美國 Promega 公司。以上研究方案已得到福建省立醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1 篩選確認研究的lncRNA? 應用癌癥基因組圖譜數據庫和基因型-組織表達數據庫篩選出在正常組織和卵巢癌組織中有差異表達的lncRNA，進行生存分析，確認具有顯著差異的前5個lncRNA，檢測其在卵巢癌細胞株中的表達，最終選擇lncRNA AC007405.3（OCPAT1）。

1.2.2 qRT-PCR? 采用Trizol法提取ES-2中的總RNA，取1 μg RNA樣本用HiScript Reverse Transcriptase （VAZYME， R101-01/02）進行逆轉錄以獲得cDNA模板;然后使用相應的引物（OCPAT1正向引物5-CAGTGCAATAGTATTGTCAAAGC-3，反向引物5-CACACAGAGGGCTACAAGAG-3;18 S rRNA正向引物5-GGAGTATGGTTGCAAAGCTGA-3，反向引物5-ATCTGTCAATCCTGTCCGTGT-3）和SYBR Green Master Mix（VAZYME，Q111-02）進行qRT-PCR檢測，每組設3個復孔。計算公式如下：目的基因ΔΔCt=目的基因ΔCt-內參基因ΔCt。

1.2.3 OCPAT1敲減質粒構建? 合成包含靶點序列的shRNA頸環結構的正反向引物（正向引物5-CGTTTAGTAAATG-3 -3，反向引物5-CAGCGAATCCT-CGTCG-3），退火后，使用T4 DNA連接酶，克隆入PLKO.1-TRC-puro慢病毒質粒載體中。

1.2.4 YOD1過表達質粒構建? 用設計好的引物（正向引物5-ATGTTTGGCCCCGCTAAAGG-3，反向引物5-CGGTGATGGCGGCAATTTG-3）以cDNA為模板，擴增YOD1基因，連接進pCDH-EF1a-MCS-T2A-puro載體（通過BamHI/EcoRI線性化后）。

1.2.5 MTT增殖實驗? 將OCPAT1敲減質粒和對照質粒瞬轉ES-2細胞，第2天鋪于96孔板中，并在貼壁后0 h、24 h、48 h和72 h用MTT試劑染色活細胞約4 h，接著吸去培養上清，加入500 μL DMSO震蕩10 min，用分光光度計測定OD490讀值。

1.2.6 流式周期實驗? 70%乙醇固定細胞過夜，清洗后處理細胞，清洗后PBS重懸并用PI染色，流式儀檢測。

1.2.7 EdU增殖實驗? ES-2細胞瞬轉相關質粒，次日鋪于96孔板，并根據EdU試劑盒說明書進行實驗。

1.2.8 流式凋亡實驗? 用不含EDTA的胰酶消化細胞，同時也要收集培養基和清洗細胞PBS中的細胞。離心沖洗，100 μL染色緩沖液重懸細胞，加入5 μL Anexin V-FITC和5 μLPI染色液，室溫反應10 min，上機。

1.2.9 細胞侵襲和轉移實驗? Transwell底膜包稀釋后，風干后加入無血清培養基。24 h后，細胞用冰甲醇固定20 min，然后用0.2%結晶紫染色20 min，通過顯微鏡隨機挑選視野進行計數，取平均值。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因實驗? ①構建OCPAT1報告基因載體pmirGLO，48 h后收取細胞，進行基因活性檢測。②構建YOD1 3UTR的報告基因載體pmirGLO，48 h后收取細胞，要求進行報告基因活性檢測。

1.2.11 FISH實驗? 將ES-2細胞鋪在無菌的蓋玻片上培養，染完DAPI后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.12 Western blot檢測各組蛋白表達? 提取ES-2細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，GAPDH為內參照，計算灰度值比值，作為其蛋白相對表達量。

1.3統計學方法

應用SPSS 22.0統計軟件分析，GraphPad Prism 5.01軟件作圖。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究OCPAT1的差異表達

①通過GTEX和TCGA數據庫，比對正常組織和腫瘤組織中OCPAT1的表達量發現，OCPAT1在腫瘤組織中高表達（圖1）。②通過RT-qPCR，檢測OCPAT1在正常細胞和腫瘤細胞中的表達量，結果顯示OCPAT1在腫瘤細胞中顯著高表達。

2.2 敲減OCPAT1，研究OCPAT1對卵巢癌細胞功能的影響

OCPAT1敲除后，ES-2細胞的細胞增殖降低，細胞增殖實驗證實敲除ES-2細胞的OCPAT1，細胞增殖降低（封三圖4）。通過實驗檢測在G0/G1期、S期相對減少（圖2）。同樣的，檢測得知敲減OCPAT1后，細胞凋亡增多（圖3）。采用Transwell migration實驗和Matrigel invasion實驗，兩個實驗結果均顯示，敲除OCPAT1后，會顯著抑制卵巢癌細胞ES-2的遷移和侵襲能力（P<0.001）。

2.3 檢測OCPAT1在卵巢癌細胞中的定位

采用FISH實驗結果顯示OCPAT1主要定位在細胞質。

2.4 驗證OCPAT1靶向miR-320d

①敲減OCPAT1，檢測miR-320d在ES-2細胞中的表達量，結果顯示升高。②將野生型和突變型OCPAT1分別克隆于螢火蟲熒光素酶基因上游，雙熒再分別與miR-320d或miRNA-ctrl同時瞬轉ES-2細胞，降解下游luciferase，熒光讀值降低，其他組不變。

2.5 驗證miR-320d靶向YOD1

①ES-2細胞過表達miR-320d，qPCR和WB檢測YOD1表達量，結果顯示降低。②將YOD1 3UTR克隆于螢火蟲熒光素酶基因上游，與miR-320d或miRNA-ctrl同時瞬轉ES-2細胞，抑制下游luciferase的轉錄，熒光讀值降低，對照組不變。

2.6 進一步驗證OCPAT1/miR-320d/YOD1通路

①敲減OCPAT1，檢測YOD1在ES-2細胞中的表達量，結果顯示降低。②敲減OCPAT1，同時過表達YOD1，顯示過表達YOD1逆轉了由于OCPAT1敲減引起的細胞功能改變。

3討論

卵巢位于女性盆腔，屬于腹膜后位器官，目前缺乏有效的篩查手段，所以良性或早期惡性卵巢腫瘤一般較難發現，使得近75%的患者發現即為晚期[5]。目前針對卵巢癌的治療以手術及以鉑類為基礎的化療為主，盡管手術技能與化療方案不斷改進，但卵巢癌的5年生存率仍提升緩慢[6]。隨著對卵巢癌標志物研究的深入、影像學診斷方法的進步及蛋白質組學技術的應用等，卵巢癌的診斷水平不斷提高，但仍未能滿足臨床的需要，目前僅25%的卵巢癌患者能早期發現。由于目前尚無高敏感度和特異度的血清腫瘤標志物， 故傾向于多種血清腫瘤標志物聯合檢測[7-8]。

人類基因組約有超30億個DNA堿基對，其中含有2.0萬～2.5萬個蛋白質編碼基因，這些蛋白質編碼基因只占據不到2%的基因組序列，剩余的近99% DNA均位于非編碼區，且基因組70%～90%轉錄成非編碼RNA[9]。參與基因調控的非編碼RNA主要分為兩類：短片段非編碼RNA（siRNA、microRNA、piRNA）和長片段非編碼RNA（lncRNA）。研究表明，lncRNA在生命活動中具有調節轉錄、轉錄后加工、蛋白質翻譯等多種作用，同時與多種疾病的發生發展有關[10]。

近年來，越來越多的研究表明，lncRNA對卵巢癌的發生和發展起重要的作用。如lncRNA EWSAT通過靶向miR-330-5p，促進卵巢癌細胞的增殖，加快癌癥的發展[11];lncRNA LINC00319可通過miR-423-5p/NACC1通路促進卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲[12];lncRNA NEAT1可以提高卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性[13];另外，lncRNA PTAR可以調節ZEB1的表達，亦促進卵巢癌細胞的上皮間質轉化，從而提高卵巢癌細胞的轉移[14]。

MicroRNA（miRNA）是一類內生的、長度為20～24個核苷酸的小RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用[15]。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。關于lncRNA與miRNA在卵巢癌發生及發展過程中的具體作用研究較少，因此探討lncRNA與miRNA的相互作用在卵巢癌發生、侵襲和轉移的過程中發揮的作用，有望為卵巢癌的治療提供新思路[16]。

YOD1作為Otubain去泛素化酶家族重要成員之一，被報道與多種疾病密切相關，包括腫瘤和神經系統疾病等，提示其具有非常重要的生物學功能。YOD1蛋白可以通過調控LATS的E3連接酶ITCH的泛素化水平調控hippo信號通路，被認為是治療肝癌的潛在靶標。并且YOD1蛋白與宮頸癌、神經退行性疾病、抗病毒免疫應答之間均有相關性報道。這些研究均提示YOD1蛋白對相關蛋白的泛素化水平調控參與到細胞重要的生命活動中，但目前YOD1基因與卵巢癌發生發展之間的關系尚沒有文獻報道，有待進一步研究。

本研究結果顯示，lncRNA OCPAT1可能在卵巢癌的發生過程中發揮癌基因作用。lncRNA OCPAT1可能主要通過增強ES-2細胞增殖活性、遷移及侵襲能力進而參與卵巢癌發生及發展過程。應用starBase網站預測出 lncRNA OCPAT1可互補結合miR-320d。為驗證lncRNA OCPAT1靶向調控miR-320d表達進而促進卵巢癌發生發展，本研究共同抑制lncRNA OCPAT1、miR-320d表達觀察細胞活性、遷移及侵襲變化，結果說明lncRNA OCPAT1可直接靶向調控miR-320d/YOD1表達，促進ES-2細胞增殖、遷移及侵襲過程。

綜上所述，lncRNA OCPAT1在卵巢癌組織及細胞中呈高表達，且與腫瘤發生及惡性化進展有關，敲減ES-2細胞中OCPAT1表達靶向miR-320d/YOD1可抑制細胞增殖及細胞侵襲力，但具體作用機制尚需進一步開展相關研究以明確。

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（收稿日期：2021-07-26）