外源性催產(chǎn)素對(duì)shank3缺陷斑馬魚成魚社交行為的影響

王 怡 劉春雪 胡純純 徐 秀

（復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院兒童保健科 上海 201102）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一類神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，社交溝通障礙是其核心癥狀之一［1］。ASD至今尚缺乏特效治療方法，癥狀往往伴隨患者一生，致殘率高。ASD的病因十分復(fù)雜，研究表明遺傳因素在ASD發(fā)病中占主導(dǎo)作用［2-4］。基因的變異（包括染色體重排、拷貝數(shù)變異和編碼區(qū)序列變異）被認(rèn)為是與ASD遺傳因素相關(guān)的主要原因［5］，突觸功能障礙可能是常見的發(fā)病機(jī)制［6］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，shank3基因的缺陷與ASD之間具有強(qiáng)烈的因果關(guān)系［7-8］。研究顯示，shank3基因缺陷是ASD最常見的單基因遺傳原因之一［9］。作為突觸蛋白中的主要支架蛋白，SHANK 3蛋白位于興奮性突觸的突觸后致密區(qū)，對(duì)突觸的正常發(fā)育和功能行使至關(guān)重要［10］。

一直以來(lái)，shank3基因缺陷患者的治療是研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，傳統(tǒng)的治療手段主要以行為干預(yù)訓(xùn)練及教育指導(dǎo)為主，但效果欠佳。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者致力于探索利用催產(chǎn)素治療ASD患者的社交缺陷。哺乳動(dòng)物催產(chǎn)素是一類主要由下丘腦室旁核和視上核合成分泌的神經(jīng)肽［11］，大部分釋放到外周血，對(duì)機(jī)體的生理功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。部分內(nèi)源性催產(chǎn)素經(jīng)神經(jīng)元纖維投射到下丘腦等中央或邊緣神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)結(jié)合膜表面的催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，OXTR）激活胞內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路［12］，調(diào)節(jié)不同的神經(jīng)回路，進(jìn)而影響行為的輸出。催產(chǎn)素可以通過(guò)加強(qiáng)社會(huì)記憶、增加社會(huì)獎(jiǎng)賞機(jī)制以及調(diào)節(jié)社交注意來(lái)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的社交認(rèn)知和社交行為［13-15］。2015 年，Penagarikano等［16］發(fā)現(xiàn)連續(xù)2周對(duì)ASD相關(guān)基因cntnap2小鼠模型進(jìn)行外源性催產(chǎn)素給藥（P7～P21），cntnap2小鼠社交行為缺陷的改善持續(xù)到P30。這項(xiàng)研究為單基因缺陷相關(guān)ASD的藥物研究提供了一個(gè)新方向。

目前藥物的開發(fā)和研究主要集中在體外篩選，雖然也能成功篩選到藥物，但難以通過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證，因此無(wú)法創(chuàng)建整個(gè)生物體的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。這些局限性在精神和神經(jīng)類藥物中尤為突出和嚴(yán)重，因?yàn)榇竽X活動(dòng)無(wú)法在體外模擬和重塑［17-19］。近年來(lái)，斑馬魚被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的分子遺傳學(xué)和藥物治療研究［20-21］。研究人員已經(jīng)建立公認(rèn)且成熟的斑馬魚行為學(xué)（社交、刻板行為、認(rèn)知等）檢測(cè)系統(tǒng)［20］，因此可以構(gòu)建ASD斑馬魚模型，并通過(guò)成熟的行為學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)量化藥物治療后的行為學(xué)指標(biāo)，判斷是否改善ASD樣行為，從而評(píng)估藥物療效。

2019 年，Sgritta等［22］報(bào)道催產(chǎn)素單劑量治療shank3b-/-小鼠模型，其社交偏好缺陷和社交互動(dòng)能力得到短暫的改善。但尚無(wú)研究報(bào)道催產(chǎn)素長(zhǎng)期治療shank3缺陷動(dòng)物模型的社交行為缺陷。本課題組在前期工作中已成功構(gòu)建了shank3ab-/-斑馬魚品系。行為學(xué)檢測(cè)提示，相比于野生型斑馬魚，shank3ab-/-斑馬魚表現(xiàn)出明顯的集群能力降低、社交偏好性降低以及重復(fù)、刻板游動(dòng)增加等孤獨(dú)癥樣表型［23］。催產(chǎn)素是一類高度保守的神經(jīng)多肽［24］，斑馬魚體內(nèi)的硬骨魚催產(chǎn)素-垂體后葉激素運(yùn)載蛋白與其他物種催產(chǎn)素前體的氨基酸序列高度相似［25］。本研究利用已構(gòu)建成功的shank3ab-/-斑馬魚模型，進(jìn)行多種形式的外源性催產(chǎn)素干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察是否改善ASD的核心癥狀，為今后催產(chǎn)素應(yīng)用于臨床治療shank3基因缺陷的ASD患者提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物shank3ab-/-斑馬魚（Tu品系）模型由本課題組的劉春雪博士構(gòu)建［23］。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)野生型（wild-type，WT）斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚：魚房恒溫28.5℃，采用與斑馬魚睡眠節(jié)律相一致的模擬晝夜交替燈光，即每天14 h（早7點(diǎn)到晚21點(diǎn)）的光照環(huán)境和10 h（晚21點(diǎn)到早7點(diǎn)）的黑暗環(huán)境。

藥物配制及給藥處理催產(chǎn)素多肽序列：NH2-Gly-Leu-Pro-Cys-Asn-Gln-lle-Tyr-Cys-OH。將催產(chǎn)素（CAS no.50-56-6，英國(guó)TOCRIS公司）用無(wú)菌水溶解到1 mmol/L儲(chǔ)備溶液中，配成催產(chǎn)素原液。實(shí)驗(yàn)開始前，將催產(chǎn)素原液用生理鹽水稀釋成5 nmol/L 工作液［26］。選取 4.5 mpf的斑馬魚雄魚進(jìn)行隨機(jī)分組：WT-sal組，WT注射生理鹽水；WTOXT組，WT注射催產(chǎn)素；shank3ab-/--sal組，shank3ab-/-注射生理鹽水；shank3ab-/--OXT組，shank3ab-/-注射催產(chǎn)素。分別進(jìn)行3種療程的給藥處理：?jiǎn)未巍⒍唐诩伴L(zhǎng)期。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 選取受精后第7天（7 dpf）、受精后第 1 個(gè)月（1 mpf、3.5 mpf、4.5 mpf）的WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚，收集單次注射催產(chǎn)素并結(jié)束行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的WT-sal組、WT-OXT組、shank3ab-/--sal組和shank3ab-/--OXT組斑馬魚，用RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取全腦總RNA，37℃連接15 min，逆轉(zhuǎn)錄PCR（85℃、5 s）后得到cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（95℃變性30 s，循環(huán)40次，95℃、30 s，60℃、30 s擴(kuò)增）檢測(cè)斑馬魚腦內(nèi)oxtr的mRNA水平（表1）。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Tab 1 Primer sequence of real-time q-PCR

行為學(xué)檢測(cè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均在溫度恒定（28.5℃）的行為房中進(jìn)行。2019年5月開始實(shí)驗(yàn)，2019年10月結(jié)束實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)段在上午8∶30到下午3∶30。利用本院斑馬魚平臺(tái)的斑馬魚行為檢測(cè)和行為學(xué)分析系統(tǒng)（viewpoint）輸出原始數(shù)據(jù)（25幀/s），再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1vs.6社交偏好實(shí)驗(yàn)（圖1）：用透明插板將實(shí)驗(yàn)缸（21 cm×10 cm×7.5 cm）平均分成右側(cè)的伙伴區(qū)域以及左側(cè)的實(shí)驗(yàn)區(qū)域兩部分。伙伴區(qū)域放入6條代表正常伙伴的WT斑馬魚，實(shí)驗(yàn)區(qū)域放入1條待測(cè)的實(shí)驗(yàn)魚，適應(yīng)15 min后進(jìn)行30 min的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)錄制。數(shù)據(jù)分析時(shí)將實(shí)驗(yàn)區(qū)域再平均分為伙伴側(cè)（社交區(qū)）以及空白區(qū)（非社交區(qū)）。WT斑馬魚傾向于緊貼伙伴魚側(cè)（社交區(qū)）游動(dòng)，在伙伴側(cè)游動(dòng)的距離和總游動(dòng)距離的比值越接近1，表示社交傾向性越強(qiáng)。計(jì)算公式：社交區(qū)游動(dòng)距離的百分比=［社交區(qū)游動(dòng)距離/（社交區(qū)游動(dòng)距離+非社交區(qū)游動(dòng)距離）］×100%。

圖1 1 vs.6社交偏好實(shí)驗(yàn)示意圖Fig 1 Sketch map of 1 vs.6 social preference test

實(shí)驗(yàn)方案單次給藥：尾鰭注射催產(chǎn)素或生理鹽水15 min后，進(jìn)行1 vs.6社交偏好性實(shí)驗(yàn)。短期療程給藥：連續(xù)7天尾鰭注射催產(chǎn)素或生理鹽水，每天一次，第8天（距上一次注射12 h）進(jìn)行1 vs.6社交偏好性實(shí)驗(yàn)。長(zhǎng)期療程給藥：連續(xù)14天尾鰭肌肉注射催產(chǎn)素或生理鹽水，每天一次，結(jié)束注射后1個(gè)月即第45天（距上一次注射1個(gè)月）進(jìn)行1 vs.6社交偏好性實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖2 斑馬魚給藥方案示意圖Fig 2 The administration schemeof zebrafish

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，使用GraphPad Prism 6軟件分析和制圖。采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)社交偏好性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行LSD多重比較檢驗(yàn)（WT-sal組和shank3ab-/--sal組，shank3ab-/--sal組和shank3ab-/--OXT組，WT-sal組和WT-OXT組）。單劑量注射后檢測(cè)斑馬魚腦內(nèi)oxtr表達(dá)，采用單因素方差分析，然后進(jìn)行LSD多重比較檢驗(yàn)。在不同發(fā)育階段，采用成組t檢驗(yàn)分析WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚腦部oxtr的mRNA表達(dá)水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

外源性催產(chǎn)素單次給藥可改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷行為在1 vs.6社交偏好性實(shí)驗(yàn)中，WT-sal組的伙伴側(cè)游動(dòng)距離比為0.98，shank3 ab-/--sal組為0.86，后者在伙伴側(cè)游動(dòng)的距離比顯著下降（0.98±0.015 vs.0.86±0.042，P=0.009），提示shank3ab-/-斑馬魚表現(xiàn)出明顯的社交缺陷行為。當(dāng)給予單次催產(chǎn)素藥物干預(yù)后15～30 min內(nèi)，shank3ab-/--sal組在伙伴側(cè)游動(dòng)距離比為0.86，shank3ab-/--OXT組則為0.96，后者在伙伴側(cè)游動(dòng)的距離比顯著升高（0.96±0.015 vs.0.86±0.042，P=0.013），社交傾向性明顯提高（圖3A）。而WT-sal組（0.98±0.015）和 WT-OXT組（0.99±0.004）在伙伴側(cè)游動(dòng)距離比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明催產(chǎn)素能改善shank3ab-/-斑馬魚的孤獨(dú)癥社交缺陷表型，但并不影響野生型斑馬魚成魚的正常社交行為。

單次催產(chǎn)素藥物干預(yù)后15～45 min內(nèi)，WT-sal組在伙伴側(cè)游動(dòng)距離比均值為0.96，shank3ab-/--sal組均值為0.87，后者社交性顯著下降（0.96±0.016 vs.0.87±0.033，P=0.007），有明顯的社交缺陷行為。shank3ab-/-催產(chǎn)素組均值為0.91，相較于shank3 ab-/-生理鹽水組，催產(chǎn)素治療組的社交傾向性有升高趨勢(shì)（0.87±0.033 vs.0.91±0.019，P=0.193），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。WT生理鹽水組（0.96±0.016）和WT催產(chǎn)素組（0.97± 0.016）的伙伴側(cè)游動(dòng)距離比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上數(shù)據(jù)表明外源性催產(chǎn)素單劑量治療即時(shí)改善了shank3 ab-/-斑馬魚異常的社交偏好行為。

外源性催產(chǎn)素短期療程給藥可短期改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷行為為了增加催產(chǎn)素在斑馬魚體內(nèi)的濃度，我們連續(xù)7天給予斑馬魚成魚外源性催產(chǎn)素進(jìn)行周期性治療，第8天社交偏好性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，shank3ab-/--OXT組伙伴側(cè)游動(dòng)的距離比均值為0.94，相較于對(duì)照的shank3ab-/--sal組（均值0.88），shank3ab-/--OXT組在伙伴側(cè)游動(dòng)的距離比升高，社交傾向性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.88±0.018 vs.0.94±0.015，P=0.006）。 WT-sal組（0.97±0.007）和 WT-OXT組（0.97±0.016）的伙伴側(cè)游動(dòng)距離比組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，外源性催產(chǎn)素短期療程干預(yù)治療能短期改善shank3缺陷斑馬魚的社交偏好缺陷（圖4）。

外源性催產(chǎn)素長(zhǎng)期療程干預(yù)治療不能長(zhǎng)期改善shank3ab-/-異常的社交缺陷行為給予斑馬魚成魚連續(xù)14天催產(chǎn)素治療，1個(gè)月后（Day45）進(jìn)行社交偏好性實(shí)驗(yàn)，shank3ab-/--OXT組（均值0.89）相較shank3ab-/--sal組（均值0.93）有傾向于伙伴側(cè)游動(dòng)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.89±0.031 vs.0.93±0.020，P=0.213，圖 5）。因此，外源性催產(chǎn)素長(zhǎng)期療程治療不能長(zhǎng)期改善shank3缺陷斑馬魚異常的社交偏好性行為。

圖3 在社交偏好實(shí)驗(yàn)中外源性催產(chǎn)素單劑量治療shank3ab-/-斑馬魚的結(jié)果Fig 3 Effects of social preference test on shank3ab-/-zebrafish under acute exogenousoxytocin exposure

圖4 在社交偏好實(shí)驗(yàn)中外源性催產(chǎn)素短期療程治療shank3ab-/-斑馬魚的結(jié)果Fig 4 Effects of short-term exposure for exogenous oxytocin on shank3ab-/-zebrafish in social preference test

催產(chǎn)素干預(yù)shank3ab-/-斑馬魚的oxtr基因表達(dá)為了分析外源性催產(chǎn)素治療能夠改善shank3ab-/-斑馬魚社交偏好缺陷的機(jī)制，我們通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)斑馬魚腦組織中oxtr基因的mRNA水平。

首先，檢測(cè)斑馬魚腦組織中oxtr在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。WT斑馬魚和shank3ab-/-斑馬魚在7 dpf、1 mpf、3.5 mpf以及 4.5 mpf這 4 個(gè)典型的發(fā)育時(shí)間段，oxtr轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平呈逐漸上升趨勢(shì)，且兩組間表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A）。

圖5 在社交偏好實(shí)驗(yàn)中外源性催產(chǎn)素長(zhǎng)期療程治療shank3ab-/-斑馬魚的結(jié)果Fig 5 Effects of long-term exposure for exogenous oxytocin on shank3ab-/-zebrafish in social preference test

其次，檢測(cè)催產(chǎn)素單次治療組和生理鹽水組的WT及shank3ab-/-（均為4.5 mpf）斑馬魚成魚腦組織內(nèi)oxtr基因mRNA即時(shí)水平，結(jié)果顯示：相對(duì)于WT-sal組，WT-OXT組的oxtr基因mRNA水平顯著升高（P＜0.001），而shank3ab-/--OXT干預(yù)組相對(duì)shank3ab-/--sal組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B）。綜上所述，外源性催產(chǎn)素干預(yù)會(huì)引起斑馬魚oxtr基因mRNA水平的即時(shí)上升。

討 論

圖6 單劑量外源性催產(chǎn)素干預(yù)后斑馬魚腦內(nèi)oxtr基因mRNA水平的比較Fig 6 Comparison of relative mRNA expression of oxtr gene in the brain of zebrafish after acute oxytocin exposure

本研究表明外源性催產(chǎn)素治療能夠改善shank3缺陷動(dòng)物模型的異常社交偏好性行為，社交缺陷改善的持續(xù)時(shí)間與給藥周期相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期療程的外源性催產(chǎn)素治療對(duì)shank3ab-/-斑馬魚成魚的社交缺陷行為沒有長(zhǎng)期影響，揭示了oxtr在shank3ab-/-斑馬魚腦內(nèi)的時(shí)間表達(dá)分布，為今后深入研究催產(chǎn)素治療shank3缺陷動(dòng)物模型提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)外源性催產(chǎn)素單劑量治療能夠即時(shí)改善shank3ab-/-斑馬魚異常的社交偏好性行為。外源性催產(chǎn)素可以通過(guò)血腦屏障，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。催產(chǎn)素治療社交缺陷的問(wèn)題之一是半衰期短，催產(chǎn)素在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的半衰期約為20 min［27］。因此單劑量給予shank3ab-/-斑馬魚魚鰭肌肉注射催產(chǎn)素后30 min內(nèi)社交缺陷得到改善，注射后45 min時(shí)社交缺陷改善不明顯。我們推測(cè)通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分外源性催產(chǎn)素，在注射后45 min時(shí)可以有效結(jié)合OXTR的催產(chǎn)素濃度已經(jīng)急劇下降，進(jìn)而不能對(duì)社交行為產(chǎn)生改善。

為了提高催產(chǎn)素在腦內(nèi)的濃度，本研究對(duì)shank3ab-/-斑馬魚進(jìn)行了持續(xù)7天的短期催產(chǎn)素干預(yù)后，其社交偏好性行為改善效應(yīng)延長(zhǎng)到給藥后12 h，較單劑量注射的改善時(shí)長(zhǎng)明顯增加。然而，持續(xù)14天的長(zhǎng)期療程結(jié)果顯示，長(zhǎng)期療程給藥并不能明顯改善shank3ab-/-斑馬魚的社交缺陷。我們推測(cè)，催產(chǎn)素療效所致社交偏好缺陷的改善可能隨著藥物代謝而結(jié)束，因而在成年shank3ab-/-斑馬魚上無(wú)法觀察到遠(yuǎn)期療效。

催產(chǎn)素的親社會(huì)影響主要通過(guò)OXTR介導(dǎo)［28］，本研究檢測(cè)了7 dpf（幼魚期）、1 mpf（青少年期）、3.5 mpf（成年早期）以及4.5 mpf（成年期）等4個(gè)發(fā)育時(shí)期WT以及shank3ab-/-斑馬魚腦內(nèi)oxtr的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)兩者之間無(wú)任何差異。我們推測(cè)shank3缺陷斑馬魚腦內(nèi)OXTR未出現(xiàn)異常，因而能與外源性催產(chǎn)素有效結(jié)合，進(jìn)而影響社交缺陷的改善。單劑量催產(chǎn)素干預(yù)后，shank3ab-/-斑馬魚腦內(nèi)oxtr的mRNA水平雖有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而催產(chǎn)素干預(yù)后WT斑馬魚腦內(nèi)oxtr的mRNA水平有顯著變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這兩者的差異還需進(jìn)一步研究。

最新研究表明Shank3缺陷影響穩(wěn)態(tài)可塑性，穩(wěn)態(tài)可塑性作為神經(jīng)可塑性的主要形式之一，外界環(huán)境變化時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)維持在一定范圍內(nèi)活動(dòng)，從而維持腦功能相對(duì)于外界環(huán)境變化時(shí)的穩(wěn)定［29］。下丘腦分泌的神經(jīng)肽催產(chǎn)素是介導(dǎo)跨感知覺模態(tài)可塑性的關(guān)鍵分子，觸覺剝奪后的小鼠給予催產(chǎn)素改善初級(jí)軀體感覺皮層可塑性的同時(shí)，也改善了初級(jí)視覺皮層的發(fā)育，繼而維持感知覺神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性［30］。shank3基因缺陷人群有嚴(yán)重的感知覺異常［31］。靶向敲除外周軀體感覺神經(jīng)元shank3基因的小鼠，除表現(xiàn)出嚴(yán)重的感知覺異常，也出現(xiàn)嚴(yán)重的社交缺陷，經(jīng)藥物干預(yù)后均有所改善［32］。因此，我們推測(cè)催產(chǎn)素可能通過(guò)改善s hank3基因缺陷受損的感知覺穩(wěn)態(tài)可塑性，從而改善shank3缺陷斑馬魚的社交缺陷。

本研究主要研究催產(chǎn)素干預(yù)成魚的療效，只檢測(cè)了oxtr基因的mRNA水平，對(duì)其他的可能分子機(jī)制未進(jìn)行分析。后期研究可針對(duì)斑馬魚發(fā)育早期（即神經(jīng)發(fā)育早期）進(jìn)行外源性催產(chǎn)素的藥物干預(yù)，以期獲得更顯著的改善作用和遠(yuǎn)期療效。

作者貢獻(xiàn)聲明王怡 研究構(gòu)思，數(shù)據(jù)采集，論文撰寫和修訂。劉春雪 論文修訂，構(gòu)建模型。胡純純，徐秀 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。