組蛋白脫乙酰酶2-核轉錄因子-κB/激活蛋白-1介導的重度哮喘對糖皮質激素不敏感的分子機制

鄧 至 鄒依寧 畢 晶 閔智慧 曾瑜真 毛若琳 姜志龍 陳智鴻△

（1復旦大學附屬中山醫院急診科，2病理科，3呼吸科，4實驗研究中心 上海 200032）

哮喘是最常見的呼吸系統慢性疾病，影響全球3.6億人口，患病率約為12.6%，每年導致至少40萬人死亡［1］，中國約有三千萬哮喘患者［2］。糖皮質激素（glucocorticoid，GC）是治療哮喘的一線藥物，大部分患者正規使用吸入糖皮質激素（inhaled corticosteroid，ICS）能達到疾病控制效果［3］。然而，有5%～10%的患者在使用高劑量ICS或長期口服GC情況下仍有哮喘的持續癥狀，這些患者被歸為重度哮喘或難治性哮喘，其病情控制一直是哮喘治療的難題［4-5］。

GC因其強大的抗炎作用，在慢性氣道炎性疾病的治療中占據重要地位。抗炎作用的發揮主要通過糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導。GC穿過細胞膜并與細胞質中的GR結合，使GR構象發生改變并與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）解離，GR隨之磷酸化，從而暴露核定位信號而轉入細胞核。在細胞核內，GR通過直接基因調控和間接基因調控調節靶基因轉錄，發揮抗炎作用。直接基因調控主要依賴GR形成同二聚體并結合抗炎基因啟動子區的糖皮質激素反應元件（glucocorticoid response element，GRE），促進組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）的結合，從而增加抗炎基因轉錄；間接基因調控主要是通過活化的GR結合HDAC等抑制因子而發生去乙酰化，從而與核因子-κB（nuclear transcription factorkappa B，NF-κB）和激活蛋白-1（activating protein，AP-1）等促炎基因轉錄因子形成復合物，并使之失活，最終減少促炎基因的表達［6-7］。在哮喘中，GC主要通過間接基因調控作用發揮抗炎效應。

近年來諸多研究致力于探討重度哮喘對激素敏感性下降的機制，包括炎性轉錄因子的過度表達，組蛋白乙酰化異常，免疫介導的細胞因子的失調，GR的結合活性及核轉移降低等［8-10］，從GC/GR及HDAC角度研究的并不多見。本研究以健康對照者、輕中度哮喘者及重癥哮喘者為對象，對比其外周血單個核細胞（peripheral blood molecule cells，PBMCs）中GR的表達量、核轉運功能、HDAC2活性及轉錄因子NF-κB、AP-1的激活情況，研究重度哮喘患者對GC敏感性下降的發生機制，為尋求重度哮喘治療新靶點和新方法提供科學依據。

資料和方法

研究對象招募來自復旦大學附屬中山醫院呼吸科的12名輕中度哮喘患者，10名重度哮喘患者和12名健康對照者（表1）。根據全球支氣管哮喘防治創議（Global Initiative for Asthma，GINA）標準，將重度哮喘的定義為需要使用大劑量的藥物以維持良好的癥狀控制或即使在使用高劑量藥物治療下，仍有哮喘的持續癥狀、急性發作或氣流阻塞。哮喘的診斷也符合GINA的診斷標準［11］。排除標準包括吸煙史、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥、肺纖維化和遺傳性激素缺乏者。健康對照均無過敏性疾病病史。

所有受試者均告知研究目的及實驗程序，并簽署知情同意書。本研究經復旦大學附屬中山醫院醫學倫理委員會批準（批號：B2014-108）。

表1 研究對象的基本信息Tab 1 Baseline characteristics of research subjects ［Mean±SD or n（%）］

主要試劑和抗體使用以下試劑：地塞米松（dexamethasone，Dex）和 TNF-α（英國 Sigma公司），HDAC2 Assay Kit（美國Abnova公司）。使用以下抗體：山羊抗兔抗體、抗GRa抗體（英國Abcam公司），NF-κB磷酸化抗體、c-Jun磷酸化抗體和c-Fos磷酸化抗體（美國Cell signaling Technology公司）。

PBMCs的分離與培養上午6～9點間抽取受試者外周靜脈血15 mL（10%EDAT抗凝），用Histopaque 1077試劑（美國Sigma-Aldrich公司）按照說明書步驟分離PBMCs。獲取的各組PBMCs在含有10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL）的1640培養液中進行培養。

各組PBMCs的刺激與處理（1）按時間梯度：0.01 ng/mL TNF-α預處理各組PBMCs，然后分別在1、2、4、6 h用0.1 μmol/L Dex處理，孵育過夜后收集上清液。（2）按濃度梯度：在各組PBMCs中分別用不同濃度的地塞米松（0.01、0.1、1、10μmol/L）或PBS預處理（空白對照組）4 h，然后用0.01 ng/mL TNF-α刺激，孵育24 h后收集上清液。

ELISA檢測按照ELISA試劑盒（美國R＆D公司）說明書步驟測定上清液中IL-8的濃度。

Western blot檢測將上述處理過的細胞在RIPA緩沖液中裂解，并提取總蛋白。然后將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質轉移至PVDF膜，以脫脂奶粉封閉后滴加第一抗體（兔抗GR、兔抗GRα、Py-NF-κB，Py-c-FOS，Py-c-JUN或GAPDH），在 4 ℃下孵育過夜（1∶2 000稀釋）。然后將膜與山羊抗兔二抗（1∶10 000稀釋）一起溫育，并使用化學發光系統進行檢測，分析總GR/GRα蛋白質水平及磷酸化的轉錄因子水平。以GAPDH用作蛋白質標準化的內參，使用Vision Works LS 6.3.3軟件進行蛋白表達的相對定量。

免疫熒光將各組受試者的PBMCs用1μmol/L的Dex分別處理0、1、2 h后提取細胞并固定涂片，加入一抗4℃過夜，次日復溫后加入二抗孵育2 h，再加入DAPI染液染色后清洗封片，用共聚焦顯微鏡檢測和觀察GRα的核內轉運情況。

HDAC2活力檢測使用細胞核抽提試劑盒（美國Epigenteck公司）提取核蛋白，并根據說明書使用HDAC2 Assay kit分析每組PBMCs樣品中HDAC2的活力。

統計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，數據以表示。首先使用單因素方差分析（ANOVA）對所有組進行統計分析，然后使用t檢驗比較組間差異的統計學意義。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

重度哮喘患者PBMCs在TNFα誘導IL-8釋放實驗中表現出對Dex敏感性下降在時間依賴實驗中，當用TNF-α對PBMCs進行孵育后，分別于 1、2、4、6 h后加入Dex，結果顯示Dex能抑制健康對照組IL-8的釋放，輕中度哮喘組在1 h時間點IL-8釋放受抑制，而后續時間點Dex抑制程度明顯下降。重度哮喘組Dex對IL-8的釋放抑制作用在每個時間點均下降，且Dex加入時間越晚，抑制效果越弱（圖1A）。在劑量依賴實驗中，用0.1、1、10μmol/L不同濃度的Dex孵育PBMCs，再加入TNF-α誘導IL-8釋放。隨著Dex濃度的逐漸升高，各組抑制IL-8釋放的作用均逐漸增加，但重度哮喘組IL-8的釋放量較健康對照組和輕中度哮喘組高（圖1B）。該結果表明，重度哮喘患者PBMCs在TNFα誘導IL-8釋放實驗中表現出對Dex敏感性下降。

圖1 TNFα誘導IL-8釋放實驗測定PBMCs對Dex的敏感性Fig 1 Dex sensitivity in TNF-α-induced IL-8 production of PBMCs

重度哮喘PBMCs的GR在Dex作用下的產生量及核內轉運情況為進一步研究哮喘患者對GC不敏感的機制，用Western blot法測定健康對照組、輕中度哮喘組、重度哮喘組的PBMCs中總GR蛋白質水平，發現隨病情嚴重程度加強，細胞總GR蛋白質水平表現出明顯的代償趨勢（圖2）。在Dex誘導GRα水平的實驗中，加入不同濃度Dex后，各組GRα水平均有增加。在健康對照組和輕中度哮喘組，Dex 1μmol/L時GRα水平明顯增高，且輕中度哮喘組顯示出良好的劑量效應關系，而重度哮喘組在Dex 1μmol/L時仍未見明顯誘導GRα水平增高（圖3）。為繼續了解GRα的核定位是否與重癥哮喘患者對GC不敏感有關，將3組患者的PBMCs加入Dex處理，于0、1、2 h分別用共聚焦顯微鏡動態觀察，測定核內GRα免疫熒光強度。結果顯示在加入Dex前，GRα主要分布在細胞質中，加入Dex處理后，健康對照和輕中度哮喘組核內GRα免疫熒光強度隨Dex作用時間呈遞增趨勢，尤其在2 h處均較空白對照明顯增強；而重癥哮喘組核內GRα免疫熒光強度隨Dex作用時間增加未見明顯遞增現象，1 h和2 h處的熒光強度與對照組相比無明顯上升（圖4）。

圖2 Western bolt檢測PBMCs中GR的表達量Fig 2 GR expression in PBMCs detected by Western bolt

圖3 Dex誘導PBMCs中GR蛋白質水平的升高Fig 3 GR expression was induced by Dex in PBMCs

重度哮喘PBMCs核蛋白HDAC2活力下降分別提取健康對照者、輕中度哮喘及重度哮喘患者PBMCs的核蛋白，并測定各組核蛋白中HDAC2的活力。研究發現，輕中度哮喘較健康對照HDAC2活力輕度降低，但差異尚無統計學意義；而重度哮喘PBMCs核蛋白中HDAC2活力較健康對照組明顯降低（圖5）。

重度哮喘PBMCs中促炎基因轉錄因子激活我們用Western blot法半定量地測定了磷酸化的NF-κB及AP-1二聚體的亞基c-Fos、c-Jun。結果表明，py-NF-κB、py-c-Fos、py-c-Jun水平在健康對照、輕中度哮喘和重度哮喘中依次升高，輕中度哮喘與健康對照相比有增高趨勢，但差異無統計學意義，而重度哮喘 PBMCs中 NF-κB、c-Fos、c-Jun的磷酸化水平明顯增加（圖6）。

討 論

重度哮喘患者占哮喘患者總人數的5%～10%，占比雖然小，但因其對大劑量、全身使用激素的依賴甚至激素抵抗，57.2%的重度哮喘患者病情未能得到有效控制［4］。重度哮喘導致的慢性小氣道炎癥具有異質性，由中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞及多種細胞因子參與，誘導痰中的嗜酸性粒細胞及中性粒細胞高于輕中度患者［10］。白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是中性粒細胞的重要趨化因子，主要來源于人PBMCs和內皮細胞，并在脂多糖和TNF-α等的誘導下合成和釋放［12］。重度哮喘患者PBMCs中出現IL-8的高表達常預示哮喘控制不良，而糖皮質激素可通過GC-GR復合物與GRE的結合直接抑制IL-8的基因轉錄。因此，本研究在體外觀察糖皮質激素對TNF-α誘導的IL-8的動態抑制作用，以評價糖皮質激素的反應性。我們的研究發現在重度哮喘患者的PBMCs中，無論在時序上還是不同濃度Dex處理下，GC對IL-8釋放的抑制作用始終低于輕中度患者及健康對照者，證實哮喘患者外周血對GC的敏感性降低，且下降程度與哮喘的嚴重程度呈正相關，因此我們猜想這種累及全身的效應或與GC-GR復合物的功能狀態相關。

圖4 免疫熒光法檢測地塞米松處理下GRα的動態入核情況Fig 4 Dex-induced GRαtransnuleus activity assessed by immunofluorescent staining

圖5 PBMCs核蛋白中HDAC2活力測定Fig 5 HDAC2 activity measurement in nucleoprotein of PBMCs

重度哮喘對GC敏感性降低機制仍不完全明確，GR的表達與活性狀態被認為是GC發揮抗炎作用的關鍵。GR 分為 GRα、GRβ、GRδ、GRγ4種亞型，研究認為GC的抗炎效應主要由GRα介導，而GRβ是其主要的負性調節因子［13］。作為皮質醇激素抗炎的基礎，大量臨床和實驗研究表明GRα表達和活性下降導致的GC抗炎作用下降是產生GC抵抗的重要原因。有研究發現，通過選擇性沉默重度哮喘患者肺泡灌洗液中巨噬細胞的GRβ基因可以提高GRα的活性與表達量，從而改善重度哮喘對激素的反應性［13］。我們的研究發現哮喘患者外周血總GR蛋白質水平并未較正常受試者降低，反而隨病情嚴重程度表現出代償性的增加（總GR蛋白質水平：重度哮喘組＞輕中度哮喘組＞健康組），進而我們考慮哮喘患者的GC不敏感與GRα的量及功能狀態可能相關。在Dex誘導GRα表達的試驗中發現，健康組PBMCs隨著Dex孵育濃度的增高可以使GRα水平逐漸升高，但重度哮喘組即使用較高濃度的Dex孵育，也不能誘導GRα的更高表達。此外，GRα轉移入核是GC發揮功能的關鍵，我們通過共聚焦顯微鏡觀察健康人與哮喘患者細胞核內GRα熒光強度的動態變化，發現健康人和輕中度哮喘者核內GRα熒光強度隨Dex的作用時間遞增明顯；但重度哮喘組并未呈現這種趨勢。我們的研究表明哮喘患者對GC不敏感的形成機制與GRα在激素誘導下的水平及GRα的核內轉移減弱相關。

圖6 Western blot檢測PBMCs中促炎基因轉錄因子活性水平Fig 6 Transcription factor activity levels of pro-inflammatory genes in PBMCs measured by Western blot

NF-κB是在促炎癥反應中起著重要作用的轉錄因子，它在細胞質中與抑制蛋白IκB結合，當細胞接受IL-2、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、TNF-α等刺激后，IκB發生磷酸化并降解，引導NF-κB從IκB中釋放并轉移到細胞核中，驅動下游促炎基因的轉錄［14-16］。AP-1是由 Fos和 Jun蛋白質組成的異二聚體，可通過結合糖皮質激素反應元件而增強炎癥基因的表達。轉錄因子NF-κB和AP-1的過度激活將增加下游促炎基因的轉錄和翻譯，并可參與糖皮質激素敏感性下降的發生機制［17］。我們的研究與此觀點相符，重度哮喘炎癥基因轉錄因子的表達明顯高于輕中度哮喘患者和健康對照者，其過度激活與GC不敏感的形成相關。

抗組蛋白乙酰化是GC減少炎癥基因轉錄的重要機制，HDAC2是GC發揮轉阻遏作用的關鍵蛋白。GC與GR結合后，可通過招募HDAC等輔助阻遏物，抑制炎癥基因轉錄因子AP-1和NF-κB的活性，從而間接抑制炎癥基因的表達。有研究表明通過保護和恢復HDAC2的活性可改善體內外試驗對象的激素敏感性［18］。然而重度哮喘患者是否存在HDAC2的表達減少及活力下降，并最終影響GC的抗炎作用，目前各試驗結果仍有爭議［19-22］。本研究比較了重度哮喘組、輕中度哮喘組及健康對照組PBMCs胞核蛋白的HDAC2活力，發現哮喘組HDAC2活性整體低于健康組，且重度哮喘組的HDAC2活性明顯低于輕中度哮喘組。說明哮喘患者存在HDAC2活力降低，且降低的程度與病情嚴重程度呈正相關。由此考慮重度哮喘對GC的不敏感或可因HDAC2活力的大幅下降造成，著力于恢復HDAC2蛋白活性的治療或可有益于改善GC的敏感性。

本研究證實了在重度哮喘患者的PBMCs中存在激素不敏感，其機制與GRα產生量及核內轉移障礙、炎性基因轉錄因子激活增加、細胞核蛋白中HDAC2活性下降相關。本研究在闡明重度哮喘患者的激素不敏感機制的同時，也為將來開發針對這一類型哮喘的新型靶向治療提供了新的思路。

作者貢獻聲明鄧至，鄒依寧 數據采集，統計分析，論文撰寫。畢晶，閔智慧，曾瑜真，毛若琳，姜志龍 數據采集。陳智鴻 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。