NGAL和KIM-1檢測在兒童膿毒癥合并急性腎損傷中的診斷價值

徐佳音 朱海燕 徐 錦

（復旦大學附屬兒科醫院臨床檢驗醫學中心 上海 201102）

膿毒癥（sepsis）是機體對感染的反應失調而導致威脅生命的器官功能障礙［1］。急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）被認為是與死亡率獨立相關的危重病并發癥［2-3］。膿毒癥兒童合并AKI發病迅速，死亡率高。目前，AKI診斷標準由2012年KDIGO（Kidney Disease Improving Global Outcomes）發布，通過尿量減少或血肌酐較其基礎值升高進行診斷，但掌握肌酐基礎值后診斷AKI需要一定時間的觀察［4］。應用KDIGO標準診斷AKI仍存在一定數量的漏診率［5］，特別對危重癥患者仍存在局限性。除了肌酐和尿量，胱抑素C（cystatin C，CysC）、視黃醇結合蛋白（retinol-binding protein，RBP）也是臨床上評價腎功能的常用指標。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和 腎 損 傷 因 子 1（kidney injury molecule 1，KIM-1）是近年診斷AKI的新的生物標志物。NGAL最早被報道于先天性心臟病患兒體外循環術后合并AKI時具有早期提示的作用，近年來的研究逐漸關注當其他疾病合并AKI時它是否同樣具有良好的診斷價值；KIM-1被認為是一種潛在的AKI標志物，但總體報道少，并多集中在尿液中KIM-1的診斷價值上。兩個標志物在危重癥兒童AKI中應用的報道均不多。基于AKI是一種與原發疾病息息相關的綜合征，同時危重癥兒童往往病情復雜，發展迅速，本研究擬通過收集不同時點的樣本，對血NGAL和KIM-1指標在膿毒癥患兒AKI早期診斷以及特殊治療過程中的臨床應用價值進行探討。

資料和方法

臨床資料連續納入2019年1—12月診斷膿毒癥、入住復旦大學附屬兒科醫院重癥監護室的患兒82例。膿毒癥診斷標準按《兒童膿毒性休克（感染性休克）診治專家共識（2015版）》［6］。按照排（剔）除標準除去13例。排除標準為各類結締組織病（如類風濕、皮肌炎）、慢性腎臟病（如慢性腎損傷）及腫瘤、免疫缺陷等基礎疾病的患兒。剔除標準為住院24 h內死亡或自動出院者。最終納入膿毒癥的患兒69例。根據膿毒癥同期是否合并AKI分為膿毒癥AKI組和膿毒癥非AKI組。AKI的診斷標準按2012年KDIGO發布的48 h內血肌酐升高＞26.5 μmol/L或大于基礎值的1.5倍（確認或推測7天發生）或持續 6 h以上尿量少于 0.5 mL·kg-1·h-1。根據診斷膿毒癥24 h內是否行連續性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy，CRRT），將膿毒癥AKI組進一步分為膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI-非CRRT組。CRRT治療組均采用連續靜脈-靜脈血液濾過透析模式（continuous venovenous hemodiafiltration，CVVHDF）。超濾量根據臨床治療要求設定在 0.5～5 mL·kg-1·h-1，透析量及濾過液量均設定為 25 mL·kg-1·h-1［7-8］，將尿量及超濾量相加作為共同的觀察指標。本研究獲復旦大學附屬兒科醫院倫理委員會批準（倫理批件號：復兒倫申〔2019〕315）。

研究方法留取膿毒癥AKI和非AKI患兒3個時點（入院后0 h、24 h、72 h）和正常對照組體檢時（所用標本為生化檢測剩余血清，≤0.5 mL）的靜脈血，3 350×g離心5 min，吸取血清放置-70℃冰箱保存備用，并檢測 NGAL、KIM-1、肌酐、CysC、RBP。NGAL和KIM-1檢測：采用ELISA方法，試劑為美國R&D公司的Human Lipocalin-2/NGAL Immunoassay和Human Serum TIM-1/KIM-1/HAVCR Immunoassay檢測試劑盒。肌酐、CysC、RBP檢測：使用美國貝克曼庫爾特有限公司AU5800全自動生化儀檢測。肌酐檢測原理為酶法，CysC和RBP檢測原理為免疫濁度法。檢測試劑、定標品、質控品均與儀器配套。尿量計量：記錄24 h時及之后每個研究觀察時點為起點的24 h尿量（mL），以患兒每公斤（kg）每小時（h）的尿量報告（mL·kg-1·h-1）；記錄膿毒癥AKI-CRRT治療組患兒超濾量（mL），以患兒每公斤（kg）每小時（h）的形式報告（mL·kg-1·h-1），并將兩者相加。小樣本量方法驗證NGAL、KIM-1試劑盒提供的參考區間，納入正常兒童均為“建立中國兒童臨床常規檢驗指標參考區間”課題招募的正常體檢兒童，符合倫理要求［9］。檢測納入研究的22例正常兒童的血NGAL、KIM-1水平，如檢測數據有離群值，剔除后補齊驗證樣本量。檢測數據≤2個結果超出待驗證區間，驗證通過；檢測數據＞3個結果超出待驗證區間，則需要檢查分析程序，根據參考人群差異自建參考區間［10］。

統計學分析正態分布的計量資料用表示，非正態分布的計量資料用中位數和四分位間距M（P25，P75）表示。分類資料統計使用χ2檢驗，組間比較用非參數檢驗k個獨立樣本Kruskal-Wallis H比較，膿毒癥AKI-CRRT組各時點間的比較用Friedman非參數檢驗。使用受試者工作特征（ROC）曲線評價肌酐、尿量、NGAL、KIM-1、CysC和RBP對AKI患兒的診斷價值，取約登指數最大時的靈敏度和特異性。以雙側檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。所有數據均使用SPSS 22.0軟件分析，Graphad Prism8軟件繪制箱式圖。

結 果

臨床資料膿毒癥AKI組28例，住院天數9～175天（M=23天）。膿毒癥非AKI組41例，住院天數7～66天（M=25.5天）。膿毒癥AKI組中進行CRRT治療者18例，膿毒癥AKI與非AKI患兒的臨床信息見表1。正常對照組：選取同期體檢的健康兒童共22例（男性12例，女性10例），其中＜1歲9例，1～4歲4例，5～9歲3例，≥10歲6例。正常對照組年齡和性別與病例組差異無統計學意義。

表1 膿毒癥AKI和膿毒癥非AKI組患者的一般臨床資料Tab 1 General clinical data of patientsin sepsis AKI and sepsis non-AKI group ［n（%）］

血NGAL、KIM-1參考區間驗證NGAL試劑盒參考區間42～177 ng/mL，檢測數據41.18～57.98 ng/mL，均值（49.5±4.44）ng/mL，1例超出待驗證區間，驗證通過。KIM-1試劑盒參考區間0～56.9 pg/mL，檢 測 數 據 14.04～52.39 pg/mL，均 值（31.43±9.86）pg/mL，均未超出待驗證區間，驗證通過。采用驗證通過的區間作為本研究的正常參考區間。

膿毒癥AKI患兒各指標的檢測結果NGAL在膿毒癥AKI組和膿毒癥非AKI組各時點的檢測水平均高于正常對照組，膿毒癥AKI組顯著高于膿毒癥非 AKI組（P均＜0.05）。24 h、72 h時膿毒癥AKI和非AKI患兒的KIM-1均高于正常對照組，這2個時點膿毒癥AKI患兒的KIM-1顯著高于膿毒癥非AKI患兒（P均＜0.05）。肌酐在3個時點、CysC和RBP在后2個時點時，膿毒癥AKI組均明顯高于非AKI組（P均＜0.05，表2）。

表2 膿毒癥AKI和非AKI患兒與正常對照組各指標檢測結果比較Tab 2 Comparison of various biomarkers at different timepoints among sepsis AKI group，sepsis non-AKIgroup and normal control group ［M（P25，P75）］

膿毒癥AKI-CRRT組、膿毒癥AKI-非CRRT組和膿毒癥非AKI組各指標檢測結果比較0 h及之后各觀察時點，NGAL、肌酐在膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI非CRRT組的檢測水平均高于膿毒癥非AKI組（P均＜0.05）。KIM-1、CysC、RBP在24 h和72 h時，膿毒癥AKI-CRRT組及非CRRT組患兒均高于膿毒癥非AKI組（P均＜0.05）。膿毒癥AKI患者無論是否進行CRRT治療，尿量均低于膿毒癥非AKI組，CRRT治療組24 h時點的尿量+超濾量高于非CRRT組（P均＜0.05）。進行CRRT治療的膿毒癥AKI患兒，與0 h時點相比，肌酐在24 h顯著升高，72 h較24 h明顯下降（P均＜0.05），NGAL、KIM-1、CysC在24 h顯著升高后保持平穩（P均＜0.05），尿量、RBP在各時點均無顯著變化（圖1A～G）。

圖1 膿毒癥AKI-CRRT組和非CRRT組及膿毒癥非AKI組各檢測指標的比較Fig 1 Comparison of various biomarkers among sepsis AKI-CRRT group，sepsis AKI-non-CRRT group and sepsis non-AKI group

經CRRT治療的膿毒癥-AKI患兒各指標診斷價值比較NGAL在0 h時的AUC面積最大（0.907），敏感度最高（92%），特異性最強（78.6%）。24 h時NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均顯示良好的診斷效能，NGAL仍顯示了最高的敏感性（96%）和特異性（98.6%）。72 h時NGAL和KIM-1的診斷效能優于其他指標，兩指標的AUC面積均＞0.9，敏感度＞90%，特異性87.1%，肌酐在72 h的的診斷敏感度降低至88%，特異性降至77.1%（P＜0.05）。RBP各時點的AUC面積均＜0.8，敏感度≤60%（表3）。

表3 CRRT治療組各指標診斷AKI的ROC曲線比較Tab 3 Comparison of ROC curves in the diagnosis of sepsis AKI-CRRT group

未經CRRT治療的膿毒癥AKI患兒各指標的診斷價值比較比較膿毒癥AKI-非CRRT治療組ROC曲線，NGAL在0 h時AUC面積最大（0.951），敏感度最高（100%），特異性87.1%，肌酐在該時點的 AUC面積較小（0.751），敏感度最低（42.9%）。24 h時NGAL、KIM-1、肌酐和CysC均顯示良好的診斷效能，NGAL仍顯示了最高的敏感度（100%）和特異性（98.6%）。72 h時除尿量外，其余各檢測指標的AUC均＞0.9（表4）。

討 論

目前，有文獻報道膿毒癥合并AKI的機制是中性粒細胞、單核細胞以及血管內皮細胞發生復雜交錯的免疫反應，腎小管在炎癥細胞的浸潤下，細胞發生自噬、凋亡以及壞死，最終造成腎小管受損而引發AKI［11-13］。在眾多新的生物標志物中，研究最多且最有臨床應用前景的是NGAL和KIM-1。NGAL主要來源于中性粒細胞，少量表達于腎、脾、肝，與明膠酶 B 相關，相對分子質量為 25 000［14］。KIM-1是來源于腎臟近曲小管上皮細胞的I型膜糖蛋白，相對分子質量39 000［15］。研究顯示NGAL、KIM-1可對先天性心臟病患兒體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）術后誘發的 AKI進行預測和診斷［16-17］。近年來的研究認為這2個生物大分子標志物對膿毒癥、接受冠狀動脈造影的急性冠脈綜合征或心力衰竭患者、泌尿系統疾病所致AKI有較好的早期診斷價值［18-21］。

在0 h、24 h、72 h的動態監測中發現：膿毒癥AKI組的NGAL、KIM-1水平均明顯高于非AKI患兒和正常對照組。當機體發生膿毒癥時，在細菌內毒素的刺激下釋放出大量內源性的炎癥介質，不僅對腎小管造成不同程度的損傷，從而導致AKI的發生，還會促進腎小管上皮細胞產生NGAL，因此膿毒癥引發AKI時NGAL明顯升高［22-24］。KIM-1來源于腎小管上皮細胞，在上皮細胞損傷時表達增強，且持續至上皮細胞修復［25］。研究認為AKI引發了ERK1/2、STAT 3磷酸化，STAT 3與KIM-1啟動子結合，增加其mRNA和蛋白質水平，KIM-1細胞外結構域的脫落導致血液或尿液中KIM-1水平大大增加［26］。國外有研究顯示，檢測尿NGAL易受尿液中白細胞的干擾影響，因此本研究采用血液標本替代尿液標本。

表4 膿毒癥AKI-非CRRT治療組各指標診斷AKI的ROC曲線比較Tab 4 Comparison of ROC curves in the diagnosis of sepsis AKI-non CRRT group

本研究中有18例膿毒癥AKI組患兒在診斷AKI后進行了CRRT。0 h時膿毒癥AKI-CRRT組和膿毒癥AKI-非CRRT組的NGAL和肌酐水平都明顯高于膿毒癥非AKI組；兩組膿毒癥AKI患兒中，NGAL的AUC面積均最大（分別為0.907和0.951），敏感度最高（分別為92%和100%），特異性強（分別為78.6%和87.1%），對膿毒癥AKI的診斷效能優于其他指標。國內研究報道，成人膿毒癥患者 NGAL 預測 AKI較肌酐可至少提前 6 h［27-29］，在兒童中 NGAL 預測 AKI的時間可提早 24 h［30-31］。張輝等［32］對92例兒童AKI標志物的研究顯示，雖在達到AKI診斷標準時肌酐的診斷特異性最好，但血肌酐的變化往往滯后于腎功能的改變，當肌酐升高程度達到診斷標準時，患兒病情已較為嚴重，因此肌酐的變化對AKI的早期診斷缺乏高敏感性。由于0 h時無法計算尿量，借助尿量診斷AKI需要一定的觀察時間，所以依靠尿量對AKI的診斷存在滯后。0 h時CysC、RBP水平在膿毒癥AKI-CRRT組、膿毒癥AKI-非CRRT組和膿毒癥非AKI組3組間比較均沒有顯著差異，提示CysC與RBP無法在早期有效區分膿毒癥是否合并AKI。NGAL在疾病早期顯著增高，因此臨床檢測NGAL可以更早地幫助預警AKI的發生，從而達到盡早干預的目的。

在行CRRT治療的AKI患兒各時點的動態監測中觀察到：72 h與24 h肌酐水平相比呈現下降趨勢，并且72 h較24 h肌酐的AUC面積減小、敏感度和特異性均降低；而NGAL、KIM-1分別在24 h顯著升高后，至72 h仍維持在較高水平，且NGAL在3個時點和KIM-1在后2個時點均維持良好的診斷效能。而膿毒癥AKI組中未行CRRT治療的患兒，各指標在72 h與24 h相比，AUC面積、敏感度和特異性均沒有明顯的變化。分析認為：目前臨床應用的CRRT濾器均采用高通量濾器，其對溶質清除截點（cut off）為20 000～250 000，這5個生物標志物的相對分子質量（Mr）從小到大依次為：肌酐（113）＜CysC（13 000）＜RBP（21 000）＜NGAL（25 000）＜KIM-1（39 000）［33］。可見在 CRRT 治療過程中，“金標準”肌酐易被濾過，從而不能反映腎功能真實情況。而NGAL和KIM-1的相對分子質量均＞20 000，理論上在CRRT治療進程中不易被清除，從而繼續維持相對穩定的高水平表達。CysC和RBP的相對分子質量與清除截點接近，也可能受到一定的影響。尿量在膿毒癥AKI-CRRT治療組和非CRRT治療組比較結果沒有顯著差異，但當將尿量加上CRRT治療過程中濾出體內的超濾量，24 h時膿毒癥AKICRRT組則高于非CRRT組。可見，CRRT治療期間由于應用了超濾模式替代腎臟排尿功能，患兒實際產生的尿量與其真實的腎功能不相符，所以無法在行CRRT過程中應用尿量反映腎功能真實情況。如需通過尿量反映AKI病情的進展，則要等待治療間隙觀察后再作評估，顯然尿量無法與治療保持同步的測量。與此同時，膿毒癥采用集束化治療，臨床應用藥物（如利尿劑）、透析等方式均有可能干擾診斷的效率。從膿毒癥AKI-CRRT組ROC曲線比較結果來看，NGAL在3個時點、KIM-1在后2個時點均保持較高敏感性及特異性，驗證了大分子標志物NAGL和KIM-1能夠更有效地反映CRRT治療后腎功能的真實情況［34-36］。

本研究的不足之處是兒童膿毒癥病例數較少，僅為小樣本量研究，得到的是初步結果，后續擬增大樣本量進一步研究NGAL和KIM-1的診斷價值。

綜上所述，重癥患兒且同時診斷膿毒癥和AKI時病情復雜并發展迅速，病程中多個生物標志物的動態監測顯示NGAL靈敏度高，對AKI的發生可能起到早期提示作用，而在血液凈化的治療過程中NGAL和KIM-1受干擾因素較少，可對這些患兒腎功能真實水平的評估提供更多的診斷指標。

作者貢獻聲明徐佳音 論文構思，執行實驗，數據采集，統計分析，撰寫和修訂論文。朱海燕 文獻調研和整理，執行實驗，數據采集。徐錦 研究指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。