環介導等溫擴增技術用于結核病診斷的價值評估

林晶晶 夏 露 劉旭暉 魏劍浩 席秀紅 黃 威 李 濤 盧水華

（復旦大學附屬公共衛生臨床中心結核科 上海 201508）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）導致的慢性傳染性疾病。早期、快速、準確地診斷TB是全球公共衛生領域的重大挑戰。TB的傳統病原學檢測多依賴于涂片法和培養法，但是由于涂片在標本中含有5 000～10 000條抗酸桿菌/mL時才會報陽［1］，靈敏度僅為30%～50%［1-2］；培養作為TB診斷的金標準，雖然靈敏度更高，但是檢測耗時（4～8周）［2］、實驗室要求高［1］、容易污染［3］。核酸檢測技術的出現在一定程度上彌補了傳統實驗室檢測的缺點，其主要包括 TB-PCR 法 、Xpert MTB/RIF（Xpert）、Xpert MTB/RIF Ultra（Ultra）、環介導等溫擴增技術（loopmediated isothermal amplification，LAMP）等。

LAMP在2016年被WHO推薦用于肺結核（pulmonary tuberculosis，PTB）檢測［4］，其原理是針對兩種靶基因（gyr B、IS6110）上的6個區段設計4個不同的引物，利用鏈置換反應在一定溫度下進行高效特異性擴增反應。這種核酸檢測技術操作簡單，耗時短，肉眼可見檢測結果，適宜在檢測條件有限的區域推廣。國外研究表明LAMP在檢測PTB患者痰標本時的靈敏度為86.0%～99.0%，特異度為94.0%～98.4%［5-6］；而在中國研究相對較少，靈敏度為96.19%～100%［7-8］，這與國外數據相近，且有研究認為對于涂陰痰標本的檢測和診斷，LAMP法優于Xpert［9］，以上研究均僅以培養作為診斷標準。雖然已有研究用于評估LAMP法在肺外結核病（extra pulmonary tuberculosis，EPTB）中的診斷價值，但是明顯少于痰標本的研究，且結果差異較大，國內相關的臨床應用評價則更少。

本研究全面評估LAMP在TB（PTB和EPTB）診斷中的應用價值，同時將其與傳統TB診斷檢測技術和Xpert進行比較。

資料和方法

研究對象本研究以2018年8月至2019年10月在上海市公共衛生臨床中心結核科住院治療的疑似活動性TB患者為研究對象。納入標準：（1）有TB的臨床表現，咳嗽咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血等；（2）有相應的影像學證據，如粟粒、斑片、結節、條索影等；（3）近12個月內有活動性TB密切接觸史；（4）有免疫學證據支持，PPD或γ-干擾素釋放實驗（interferon-γrelease assay，IGRA）陽性。排除標準：（1）沒有完成本研究涉及的檢測，或未獲得有效的檢測結果；（2）缺少明確的臨床診斷。本研究以BACTEC MGIT 960液體培養為診斷活動性TB的金標準。確診TB患者為液體培養陽性且MPB64陽性。TB臨床診斷標準參照《肺結核診斷標準（WS 288—2017）》［10］和綜合參考標準（composite reference standards，CRS）［11］，若均不符合則為非結核病病例。非結核分枝桿菌（Nontuberculous Mycobacterium，NTM）病指BACTEC MGIT 960液體培養基上有菌落生長，MPB64陰性，且菌種鑒定明確菌種類型的。抗結核活性藥物暴露史指有任何一種抗結核活性藥物暴露史。

所有患者均記錄年齡、性別等基本信息，行胸片或胸部CT、免疫學檢測，詢問發病情況及是否有抗結核活性藥物暴露史。本研究通過上海市公共衛生臨床中心倫理委員會審核同意（倫理號：2018-S013-02）。

實驗標本與方法

標本采集 呼吸道標本：留取喉嚨深部痰或誘導痰；電子熒光氣管鏡檢查后灌洗液、支刷物。肺外標本：胸腹水、穿刺液、尿液、腦脊液等。

實驗方法 本研究中采集的實驗標本每份都分成4份，分別行以下檢測，（1）涂片：按照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》中的標準化操作程序檢測。涂片陽性指熒光染色結果分級達1+及以上。（2）BACTEC MGIT 960液體培養：將經NaOH前處理過的呼吸道標本加入MGIT 960液體培養管或羅氏改良中培養4～8周。培養基上生長的菌落進行初步膠體金檢測，即分 枝 桿 菌 蛋 白 64（mycobacterial protein 64，MPB64）檢測。（3）Xpert：按照 MTB GeneXpert試劑盒中的說明書進行操作。（4）LAMP：采用日本榮研公司試劑盒。用移液器吸取痰標本或陰性對照40～60μL加入樣本處理管，混合后加熱至90℃，5 min，再將其旋轉安裝在吸附劑管上，充分混勻后將樣本溶液滴加入擴增反應管，在67℃下進行擴增反應40 min，最后通過熒光目視判斷結果。

統計學分析如果樣本未進行涂片、培養、LAMP、Xpert中的任一檢測，則不被納入分析。靈敏度（sensitivity，Se）指實際患病人群中某一檢測方法的陽性率，特異度（specificity，Sp）指實際未患病人群中某一檢測方法的陰性率。陽性預測值（positive predictive value，PPV）、陰 性 預 測 值（negative predictive value，NPV）也作為分析指標，95%CI作為總體參數估計指標也一起計算。獨立樣本的計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。一致性分析采用Kappa（κ）檢驗。本文主要分析以痰液為標本時不同檢測方法間的比較，采用SPSS Statistics 25軟件和GraphPad Prism 8軟件進行統計分析。

結 果

研究共入組315例疑似TB患者，包括261例疑似活動性PTB，其中46例提供非痰標本，54例為疑似活動性EPTB患者。

LAMP在痰標本檢測中的應用本研究中有215例疑似活動性PTB患者提供痰標本（圖1），其中31例因檢測不全而未被納入檢測，9例患者重復采樣而未被納入統計分析，最終175例納入分析。男性患者有115人，占65.7%，15歲及以上患者占97.8%，40歲及以上占66.3%。175例中有124例（70.9%）臨床診斷PTB，51例（29.1%）為其他呼吸道疾病（包括15例NTM），71例（40.6%）確診PTB。具有咳嗽和（或）咳痰≥2周患者有73例（41.7%），發熱34例（19.4%），咯血或痰中帶血 27例（15.4%）；影像學檢查提示結核可能有119例（68.0%），其中82例呈現典型改變。在124例臨床診斷PTB患者中有65例（52.4%）有抗結核活性藥物暴露史，59例（47.6%）無抗結核活性藥物暴露史。

圖1 患者入組及分析流程圖Fig 1 Flow chart of patient enrollment and the results of the diagnostic tests

LAMP的檢測效能及與其他檢測方法的比較175例患者中有86例（49.1%）患者的痰標本培養陽性，其中 71例 MPB64陽性（確診 PTB），15例MPB64陰性且菌種鑒定證實為NTM菌株。在確診PTB患者中，LAMP、Xpert及涂片的靈敏度為78.9%（95%CI：68.3～87.1）、84.5%（95%CI：74.8～91.5）和70.4%（95%CI：59.2～80.1），差異無統計學意義。但是，當以采集標本前是否有抗結核活性藥物暴露史進行分層時，發現其對這3種靈敏度均有影響。在無抗結核活性藥物暴露亞組，LAMP的靈敏度為71.1%（95%CI：56.9～82.7），仍位居第二；在有抗結核藥物暴露亞組，LAMP的靈敏度為92.3%，高于Xpert（88.5%）及涂片（73.1%）（表1）。

LAMP（82.7%，95%CI：74.6～89.0）、Xpert（84.6%，95%CI：76.8～90.6）和涂片（82.7%，95%CI：74.6～89.0）的特異度均相近。陽性預測值方面，LAMP也與Xpert相近。陰性預測值以Xpert最高，LAMP次之。

表1 4種檢測方法Se、Sp、PPV、NPV的比較Tab 1 Comparison of Se，Sp，PPV and NPV of the four tests

對于確診PTB患者的檢測，我們發現LAMP與Xpert的一致性中等（κ=0.438）；與涂片的一致性一般（κ=0.336）。

在124例臨床診斷PTB中，涂片的靈敏度（46.0%）最低（表2），且與LAMP、Xpert的靈敏度差異有統計學意義（涂片vs.LAMP，P=0.004；vs.Xpert，P=0.001）。 LAMP 的 靈 敏 度 為 58.9%（95%CI：50.1～67.2），Xpert為 61.3%（95%CI：52.5～69.5），培養為 57.3%（95%CI：48.5～65.7），這3種檢測方法靈敏度的差異均無統計學意義。由分層分析（表2）可知，在無抗結核活性藥物暴露亞組，LAMP（54.8%，95%CI：43.4～65.8）的靈敏度位居第三，但與培養、Xpert相近，差異無統計學意義；在有抗結核活性藥物暴露亞組，LAMP的靈敏度（64.7%，95%CI：51.1～76.7）最高，明顯高于涂片的靈敏度（49.0%，95%CI：35.7～62.5，P=0.008），培養的靈敏度降至 51.0%（95%CI：37.5～64.3），Xpert的靈敏度為62.7%（95%CI：49.1～75.0）。

表2 4種檢測方法在有無抗結核活性藥物暴露史組別中靈敏度的比較Tab 2 Comparison of sensitivity of four test sinsub groups with or without exposure history to anti-TB antibiotics

結合臨床癥狀分析發現，在咳嗽和（或）咳痰≥2周的52例PTB患者中，LAMP的陽性率為75.0%（39/52），而在其他72例患者中的陽性率為47.2%（34/72），Xpert（71.1%vs.51.4%）、涂片（57.7%vs.37.5%）、培養（69.2%vs.48.6%）在兩組的陽性率比較仍有待進一步驗證；在17例咯血或痰中帶血的PTB患者中，LAMP、Xpert、涂片、培養的陽性例數分別為 8、8、6、6例；在 24例發熱 PTB 患者中，LAMP、Xpert、涂片、培養的靈敏度為分別75.0%（18/25）、70.8%（17/24）、66.7%（16/24）、54.2%（13/24）。

LAMP的特異度為98.0%，陽性預測值為98.6%，低于Xpert，特異度、陽性預測值均為100%。而涂片和培養由于NTM的影響，特異度及陽性預測值均不高，培養的特異度僅70.6%。在陰性預測值方面，LAMP高于涂片和培養，略低于Xpert。

一致性檢驗發現：LAMP與Xpert的一致性較強（κ=0.714）；LAMP與涂片、培養的一致性中等（LAMPvs.涂 片 ，k=0.555；LAMPvs.培 養 ，κ=0.470）。

LAMP、Xpert、培養檢測效能與樣本中MTB菌量的關系根據涂片結果，樣本可分為5個等級（0～4+）。124例臨床診斷PTB患者的痰涂片陰性率為54.0%（67/124），此時培養、LAMP、Xpert的陽性率最低，但是差異無統計學意義（P=0.708）。各種檢測技術的陽性檢出率隨著涂片等級增加而提高，在涂片3+及4+的樣本中的檢出率均為100%。在同一涂片等級時，各種方法的靈敏度雖有差異，但是差異均無統計學意義（表3）。

表3 臨床診斷TB中不同涂片等級時LAMP、Xpert及培養的檢測效能Tab 3 Sensitivity of LAMP，Xpert，Culture in subgroupswith different AFB smear grade in clinical TB

在臨床診斷PTB的培陰樣本中，LAMP與Xpert的檢出率相似（P=1.000），且兩者的檢出率均明顯高于涂片（P＜0.05）；雖然在21例培陽涂陰樣本中，LAMP僅檢出12例，低于Xpert的16例，但是在4種類型標本中，兩者的檢出率差異均無統計學意義。而且LAMP與Xpert檢測結果的一致性較強（κ=0.778），與涂片的一致性中等（κ=0.485）。

LAMP在非痰標本中的應用研究共有100例患者提供了非痰標本，其中20例因檢測不全而被排除，最終80份樣本數據納入分析。具有相應器官或部位臨床癥狀及體征者有64例（80.0%）；影像學檢查異常者有72例（90.0%）。80例中有47例（58.75%）臨床診斷TB，其中18例診斷為PTB，標本類型為灌洗液、支刷物、胃液，29例標本類型為尿液、腦脊液等，診斷為EPTB；有13例（16.25%）確診TB。在47例臨床診斷TB中有19例（40.4%）有抗結核活性藥物暴露史，28例（59.6%）無抗結核活性藥物暴露史。80份非痰標本中有25份（31.25%）胃液，16份（20.20%）灌洗液，10份（12.50%）腦脊液，10份（12.50%）胸水，6份（7.50%）尿液，5份（6.25%）支刷物，4份（5.00%）穿刺液，2份（2.50%）糞便，腹水和組織各1份（1.25%）。

LAMP的檢測效能及與其他檢測方法的比較LAMP的靈敏度為61.5%（8/13），Xpert的靈敏度為76.9%（10/13），均高于涂片（30.8%）。對于在采集樣本前有抗活性結核藥物暴露史的3例患者，Xpert均提示陽性且利福平耐藥，而LAMP及涂片法檢出2例；在無抗結核藥物暴露史亞組的10例患者中，LAMP及Xpert陽性例數分別為6例和7例，涂片僅檢出2例陽性，且涂片等級均為1+。

LAMP 的特異度（92.5%，95%CI：84.4～97.1）高于 Xpert（91.0%，95%CI：82.5～96.2），均低于涂片（98.5%，95%CI：93.2～99.8）。

LAMP與培養法的的靈敏度（27.7%，95%CI：16.5～41.5）一致 ，次于 Xpert的靈敏度（34.0%，95%CI：21.8～48.2），三者差異無統計學意義，且明顯高于涂片的靈敏度（10.6%，95%CI：4.2～-21.8）（P均＜0.05）。以采集標本前患者是否有抗結核藥物暴露史進行分組，分析發現在19例有抗結核活性藥物暴露史亞組，LAMP的靈敏度與Xpert相同，均為26.3%（5/19），培養法檢出3例陽性，涂片僅檢出2例陽性；在28例無抗結核活性藥物暴露史亞組，LAMP的靈敏度為 28.6%（8/28），僅次于Xpert（39.3%，11/28）及培養（35.7%，10/28），涂片檢出 3例陽性。所有涂陽標本LAMP及Xpert檢測均提示陽性；在33份培陰涂陰標本中，LAMP、Xpert分別檢出4例（12.1%）、5例（15.2%）陽性；在9份培陽涂陰標本中，LAMP、Xpert分別檢出4例（44.4%）、6例（66.7%）陽性。

討 論

通過本研究發現，用于診斷TB時，相比傳統的病原學檢測方法，LAMP的靈敏度和特異度均有提高，這與文獻報道一致［5，12］，而且與 Xpert的檢測效能差異并不明顯。一致性檢驗提示LAMP與Xpert一致性較強，與培養的一致性中等。可見在臨床應用中，與傳統病原學檢測方法，尤其是涂片相比，LAMP的高靈敏度有助于快速、準確地診斷TB。

本研究通過亞組分析發現抗結核活性藥物的暴露對結核菌涂片、培養及分子生物學檢測等方法均有影響，且對結核菌培養的影響大于對涂片及分子生物學檢測的影響，培養的靈敏度在有抗結核活性藥物暴露史后降低，而其他方法均有不同程度的提高。本研究的抗結核活性藥物暴露亞組中12%的患者的痰標本為涂陽培陰，主要是由于抗結核活性藥物的暴露降低了Mtb菌株活性，導致培養困難及靈敏度降低［5］，而死菌排出仍保留抗酸染色的特性［13］。另外，對于有抗結核活性藥物暴露史的患者，LAMP的靈敏度優于結核菌培養，這與既往研究相符［5］，因為核酸在菌株死亡后仍能存留較長時間［14］。在臨床工作中，患者在診斷TB前常會被按照社區獲得性肺炎或院內獲得性肺炎予以抗感染處理，常用的抗感染藥物中氟喹諾酮類、碳青霉烯類等均有較強的抗結核活性［15］，這為結核菌的檢出帶來一定的挑戰。鑒于喹諾酮等抗生素的廣泛使用，對有抗結核活性藥物暴露史的患者使用分子生物學方法檢測結核菌優于結核菌培養法。同時，該研究也表明，在抗結核治療的過程中，分子生物學方法不能替代結核菌培養用于療效監測［13］。

此項研究還表明LAMP在菌量較多的PTB中有助于早期診斷，但是對少菌型PTB診斷的準確性都仍有待提高。另一新型核酸檢測技術Ultra的出現可能解決目前常用檢測方法對少菌型TB檢出率低的問題［14］。研究中出現的1例LAMP假陰性患者在隨訪中被證實為TB合并NTM肺病，這可能與實驗時吸取標本的部分有關，如未吸取膿痰部分而吸取稀薄部分。

本次研究中有15例NTM肺病，包括膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等感染引起的肺病。由于受NTM影響，涂片和培養的特異度均不高，而LAMP與包括堪薩斯分枝桿菌等16種非結核分枝桿菌無交叉反應性。在本次研究中LAMP出現1例假陽性，這例NTM肺病患者既往有結核病史。關于同樣以核酸檢測為原理的Xpert檢測法的研究指出，有7%的患者在治療結束后的5～19個月可出現Xpert假陽性［16］，這是因為 Xpert檢測方法無法將不完整的、死細胞中的基因組DNA剔除［17］，且與宿主對其清除延遲有關［16］，免疫低下者更甚，本例的LAMP假陽性患者為老年女性，因此考慮為痰標本中含有Mtb死菌引起，但是在此次確診前診斷性抗結核治療3個月，因此也不排除患者同時患有TB合并NTM肺病的可能。

本研究發現，在非痰標本中，LAMP法的檢測效能相比涂片法有所提高（61.5%vs.30.8%；27.7%vs.10.6%），而相比Xpert差異無統計學意義（P=0.453）。LAMP檢測方法能檢出所有涂陽標本，即在培陽涂陽標本中的靈敏度為100%（4/4）。而且由于非痰標本含菌量少，無論是Mtb還是NTM，4種檢測方法的特異度均較高。這說明LAMP法適用于非痰標本檢測。

目前EPTB有增加趨勢［18-19］，有調查顯示中國EPTB約占33.4%［20］，目前仍需新型的、高效的的實驗室檢測技術，以期更早期、準確地檢出活動性EPTB。本次研究中LAMP法用于非痰標本時，相對于傳統檢測病原學檢測方法及其他核酸檢測技術，并未顯示出明顯的優勢：一是由于本項研究中所入組非痰標本的菌量低［21］；二是每項研究所入組標本類型及各類型標本數所占比例不同；三是由于非痰標本樣本量少，培養陽性的樣本數更少，結果并不具有代表性；四是非痰標本類型多但單一類型的標本數量極少。此項研究無法得出LAMP法在各種類型標本中的檢測效能，因此并不能明確評估LAMP法在EPTB中的應用價值。

本研究的可取之處在于包括胃液、灌洗液、穿刺液等多種類型的非痰標本，但存在一定的局限性，主要為樣本量的限制導致部分靈敏度差異并不顯著，此外所有患者均為HIV檢測陰性人群，未驗證LAMP在HIV合并TB人群中的檢測效能。

LAMP在TB的診斷中具有較好的靈敏度和特異度，與Xpert檢測結果一致性較高，與培養一致性中等，優于結核菌涂片法；在有抗結核活性藥物暴露史的患者中，LAMP有可靠的檢出率。LAMP操作簡單，可通過肉眼直接判定結果，操作人員即使沒有專業的分子檢測技術經驗仍可獨立完成檢測，因此具有較高的應用前景。

作者貢獻聲明林晶晶 收集樣本，實驗，數據統計分析及論文撰寫。夏露，劉旭暉 樣本收集，統計指導，論文修改。魏劍浩 參與實驗。席秀紅，黃威，李濤 樣本收集。盧水華 實驗設計和安排，論文指導及修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。