印跡基因PHLDA2在孕婦子癇前期胎盤中的差異表達和甲基化狀態

朱 好 胡 蓉 顧蔚蓉

（復旦大學附屬婦產科醫院產科 上海 200011）

PLHLDA2（Pleckstrin homology-like domain，family A，member 2）是位于染色體11p15的母源性印跡基因，主要在胎盤中表達，既往研究發現PHLDA2與子代出生體重呈負相關［1-2］，通過促進滋養細胞凋亡、抑制滋養細胞侵襲，在妊娠并發癥的發生發展中起到重要作用［3］。本研究采用Realtime PCR和焦磷酸甲基化測序方法檢測子癇前期孕婦胎盤組織中印跡基因PHLDA2的表達改變和甲基化差異，初步了解PHLDA2與子癇前期的關系。

資料和方法

研究對象 早發型子癇前期4例、晚發型子癇前期16例及正常對照組30例子代胎盤組織均來源于復旦大學附屬婦產科醫院2017年6月—2018年12月分娩的產婦。各組孕婦知情同意將組織進行科學研究，本研究獲得復旦大學附屬婦產科醫院倫理委員會批準（批件號：Kyy2016-42）。

納入標準 子癇前期組為根據《婦產科學》（第九版）［4］教材，符合子癇前期及慢性高血壓并發子癇前期，系自然妊娠且無其他妊娠合并癥者的胎盤組織；其中發病孕周＜34周者為早發型子癇前期，發病孕周≥34周者為晚發型子癇前期。正常對照組為自然妊娠且無妊娠合并癥者的胎盤組織。

排除標準 合并內科或外科的合并癥，包括糖尿病、腎炎、心臟病、貧血、肝炎、妊娠期肝內膽汁淤積癥、性傳播性疾病，以及其他孕婦內外科疾病。合并妊娠期或分娩期的并發癥，如前置胎盤、胎盤早剝、產時發熱、胎兒窘迫、羊水量異常、胎兒畸形、巨大兒、胎兒貧血、胎兒先天性疾病等。

妊娠結局及新生兒情況 記錄各組一般信息、分娩方式、孕齡和新生兒出生體重、Apgar評分等。

標本采集 胎盤娩出后立即無菌下留取母體面中央區胎盤組織（避開鈣化區），剪去表面蛻膜組織后，留取約200 mg組織塊，置凍存管中后置液氮罐中，30 min后轉移至-80℃冰箱儲存。

Real-time PCR取約直徑5 mm凍存胎盤組織加入1 mL Trizol，充分研磨后抽提總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度并計算其濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳分析其產物，確定RNA完整性。采用20 μL反轉錄體系，試劑盒購自Invitrogen公司。NCBI查詢mRNA序列，primer3軟件篩選出一對cDNA引物（蘇州金唯智公司合成）。PHLDA 2上游引物序列5’-GCTTCCACTCCATCCTCAAG-3’，下游引物5’-GGTTCTGG-AAATCGATGAGC-3’，擴增片段長159 bp；GAPDH上游引物序列5’-GCGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’，下游引物序列 5’-GTTCA-CACCCATGACGAACAT-3’，擴增片段長172 bp。使用7500 Fast Real-time PCR System，采用10μL反應體系，95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火10 s，45個循環后反應結束，確認Realtime PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR相對定量。目的基因mRNA的表達水平根據PCR擴增曲線所得CT值，以GAPDH基因為內參，比較內參基因與目的基因的CT值，得出各標本之間目的基因 表 達 量 的 多 少 。 計 算 公 式 ：ΔCT=CT目的基因-CT管家基因；相對含量（%）=2-ΔΔCT×100%，其中ΔΔCT=（CT目的基因-CT管家基因）實驗組-（CT目的基因-CT管家基因）對照組。

焦磷酸甲基化測序 啟動子區Cp G島引物由PyroMark Assay Design 2.0設計，由生工基因合成，所選擇Cp G島區域設計焦磷酸測序模板制備引物和測序引物。PHLDA 2上游引物序列5’-GTAATGGGTATAGTGATGTAAAAATAAGAT-3’，下游引物序列3’-CACAACTC-TCTAACCCAATCCTTTC-5’，測序引物序列 5’-ATTAGATAGTTTAATAATTTAAGG-3’。使用QIAGEN基因組DNA抽提試劑盒，從凍存胎盤組織中提取基因組DNA，計算所提取DNA含量并保存，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。應用PyroMark Q48軟件對焦磷酸測序結果進行分析。

統計學分析 分析采用SPSS l7.0軟件包，計數資料采用χ2及Fisher精確檢驗；計量資料比較采用單因素方差分析及t檢驗，結果用表示。

結果

臨床資料 與正常對照組比較，早發型子癇前期組分娩孕周?。≒＜0.000）、手術助產率高（P=0.015）、新生兒出生體重低（P＜0.000）、1 min低Apgar評分率高（P＜0.000）；晚發型子癇前期組手術助產率高（P=0.012），如表1所示。進一步比較早發型子癇前期在分娩孕周（P＜0.000）、出生體重（P＜0.000）、1 min低 Apgar評分發生率（P=0.003）較晚發型病情更早更重。本研究中有2例SGA均為早發型子癇前期，出生體重分別為1 650 g（35+2周）、1 720 g（36+4周），3組均無新生兒死亡。

子癇前期PHLDA2 mRNA的表達改變 用SYBR GreenⅠ熒光Real-time PCR法檢測發現，晚發型子癇前期組胎盤PHLDA2的mRNA表達較對照組明顯降低（P=0.019），而早發型子癇前期與晚發型、正常對照組之間差異均無統計學意義，如表2所示。

表1 早發型、晚發型子癇前期組與正常對照組臨床資料的比較Tab 1 Clinical features and obstetrical outcomes among the three groups

表2 3組胎盤印跡基因PHLDA2表達差異比較Tab 2 The expression of PHLDA2 in placenta among the three groups

子癇前期PHLDA2啟動子甲基化的表達改變用焦磷酸甲基化測序的方法檢測發現，各組之間的胎盤組織中PHLDA2啟動子區甲基化程度差異均有統計學意義（P＜0.000），由高到低依次為早發型、晚發型、對照組（表3）。

討論本研究檢測了子癇前期組和正常對照組胎盤組織中PHLDA2基因表達和啟動子區甲基化情況，結果顯示子癇前期組胎盤組織中PHLDA2 mRNA表達降低，而啟動子區呈高甲基化表達狀態。這一結果在子癇前期的研究中為首次報道。

子癇前期的發病率約為7%～10%［5-6］，占孕產婦死亡的 9.2%［5，7］，影響圍產兒結局和遠期預后［8］，其中早發型子癇前期發生胎盤組織病變比晚發型更常見，易導致更嚴重的母體及胎兒并發癥［9-10］，因此需要更積極的臨床干預。本研究中早發型患者分娩孕周較晚發型和正常對照產婦平均提前了約3周，且均接受了剖宮產終止妊娠，分娩孕周的提前導致了新生兒出生體重較低，發生1 min低Apgar評分較多，這些結局與早發型子癇前期的病情出現更早、母兒并發癥更嚴重相關。

表3 3組中PHLDA2啟動子區甲基化情況比較Tab 3 The methylation statue in promoter region of PHLDA2 among three groups

子癇前期胎盤娩出后臨床癥狀和體征可自然消退，因此被認為是與胎盤密切相關的疾病，并且可能是一種與母系表達的印跡基因異常的疾?。?1］。從表觀遺傳學角度探討印跡基因對滋養細胞侵襲行為的調控分子機制與印跡基因中胞嘧啶甲基化尤其是Cp G島的甲基化密切相關［12］。本研究中子癇前期孕婦PHLDA2啟動子區呈高甲基化表達，提示表觀遺傳的改變可能是導致胎盤內PHLDA2 mRNA的表達抑制的原因，從而導致子癇前期的發生和發展。印跡基因異常表達所導致的妊娠期并發癥往往還與胎盤功能異常有關，動物實驗發現PHLDA2基因表達與胎兒及胎盤重量呈負相關［13-14］，限制胎盤糖原累積［14］。對人類胎盤的研究中發現，高表達PHLDA2可導致滋養細胞功能下降，使胎盤功能受限，進一步導致FGR、早產、流產等妊娠并發癥［1，3］。低表達PHLDA2 可導致出生體重增加和胎盤肥大［15］。本研究結果中PHLDA2 mRNA在胎盤內的表達減少與既往FGR的研究結果相反，提示晚發型子癇前期胎盤PHLDA2表達較少，也可能是缺氧導致滋養細胞侵襲力降低后的反向保護作用。

綜上，本研究觀察到印跡基因PHLDA2在子癇前期胎盤內的表達差異和表觀遺傳學改變，初步了解基因的低表達和啟動子區Cp G島高甲基化與子癇前期的關系，為子癇前期分子機制提供了依據。

作者貢獻聲明朱好 論文設計，數據采集和統計分析，論文撰寫和修訂。胡蓉 數據統計與分析，修訂論文。顧蔚蓉 論文構思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。