好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈產類胡蘿卜素的研究

吳永存，李蘭欣，辛嘉英

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150028）

類胡蘿卜素（Carotenoid）是一類重要天然色素的總稱，主要存在于動物、高等植物、真菌等色素中，動物體本身不能合成類胡蘿卜素，必須通過外界獲得。其中，β-類胡蘿卜素具有十分顯著的抗氧化和增強免疫活性的作用[1]；類胡蘿卜素屬于脂溶性維生素，是一種天然的著色劑，對改善畜禽肉、蛋、乳、皮毛等品質具有重要作用[2]；類胡蘿卜素還可以提高動物的免疫能力和抗應激能力，對動物的正常生長發育有重要意義。

好食脈孢菌（Neurospora sitophila）又名為鏈孢霉或紅色面包霉，經過FDA認證其不產生毒素，且對基質適應性廣，可以在豆渣、酒糟等農副產品上生長[3]。相關研究表明，好食脈孢菌是一種對營養要求簡單、生長速度快、菌體營養豐富、無毒性和致病性的好氧菌。可以在固體基質上生長繁殖，其營養菌絲會深入到基質中吸收養分，氣生菌絲向空氣中伸展并發育繁殖菌絲產生孢子。經過好食脈孢菌發酵后得到的產物，營養價值及食用口感等方面顯著提高[4]，并且好食脈孢菌酶系廣泛，主要由纖維素酶等組成，有利于對粗纖維和木質素進行降解，發酵后得到的產物沒有不良氣味[5]，可用于飼料的發酵。

紅酵母（Rhodotorula）屬隱球酵母科，細胞為圓形、卵形或長桿形，對環境的適應能力強，最顯著的特點是能生成天然類胡蘿卜素。近年來，紅酵母被廣泛應用到發酵領域，對紅酵母發酵產類胡蘿卜素方面的研究也被越來越多的人重視。紅酵母的生長和繁殖能力強、對生長環境條件要求較低，并且菌體營養豐富[6]。由于紅酵母的這些優良特性，紅酵母被廣泛應用于食品、化工、環境保護、動物飼養等方面[7]，而紅酵母的主要代謝產物為類胡蘿卜素[8]。

玉米秸稈的粗纖維含量高、蛋白質含量低、木質素與蠟質在秸稈中互相纏繞，形成難以破壞的結構，造成直接飼喂秸稈營養價值低、飼喂效果差，并且很少被用于直接飼喂動物，只有極少量的秸稈被利用，大量秸稈都以焚燒的方式進行處理[9]。燃燒秸稈對空氣質量產生較大的影響，使季節性霧霾加重。

相關研究表明，以豆類、水果等原料加工后產生的殘余物，通過好食脈孢菌和紅酵母協同發酵產類胡蘿卜素，并使糟渣粗纖維含量降低，蛋白質含量身高，從而提高糟渣的營養價值與飼用效果[10]。玉米秸稈發酵后，營養成分顯著提高，口感也會提高[11]。發酵過程中可加入麩皮，麩皮可促進需氧菌的生長[12]。以玉米秸稈為發酵原料，麩皮作為碳源、干豆渣作為氮源，利用好食脈孢菌和紅酵母固態發酵玉米秸稈，通過優化培養基條件和發酵條件，使發酵后的秸稈變得松軟，可促進動物的食欲、減輕動物消化的負擔，在類胡蘿卜素產量提高的同時，提高玉米秸稈的利用價值，為工廠化生產功能性玉米秸稈飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米秸稈，購自黑龍江省綏化市蘭西縣；麩皮、干豆渣、丙酮。

DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱、電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械場產品；HZQ-D型恒溫振蕩器，中國·哈爾濱東聯電子技術開發有限公司產品；DL-CJ-2NDI超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品；UV-2550型紫外-可見光光度計、TGL-16G型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品。

1.2 菌種與培養基

1.2.1 菌種

好食脈孢菌、紅酵母（食品級實驗室提供）。

1.2.2 培養基

（1）好食脈孢菌的培養。將新鮮土豆切成2 mm左右薄片，稱取50 g于沸水中煮5 min，自然冷卻后用4層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖和瓊脂各4 g，加蒸餾水定容至200 mL，分別裝入三角瓶中，經121℃濕熱滅菌20 min后搖勻擺斜面，待冷卻后向培養基斜面接種好食脈孢菌，于28～30℃下恒溫培養3 d，待培養基長滿金黃色孢子后備用。

（2）紅酵母的培養。準確稱取1.5 g葡萄糖，0.5 g蛋白胨，2.0 g瓊脂，0.054 g硫酸鎂、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀各0.05 g，加入100 mL蒸餾水，分別裝入三角瓶中，經121℃濕熱滅菌20 min后搖勻擺斜面，凝固3～4 h，向培養基偏上位置接種紅酵母菌，于28～30℃下恒溫培養3 d，待培養基長滿紅色孢子后備用。

（3）固態發酵。向250 mL錐形瓶中加入10 g秸稈粉，其他原料與配比依據試驗確定，將錐形瓶用8層紗布和4層報紙密封，放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行121.0℃滅菌1 h。置于超凈工作臺，冷卻后加入好食脈孢菌（接種量為10%）和紅酵母菌（接種量為10%），攪拌均勻于培養箱中進行發酵培養。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

以類胡蘿卜素產量為指標，首先確定培養基條件，包括培養基初始pH值、水分含量、碳源用量、氮源用量、無機鹽添加量和培養基裝量。

小麥麩皮是小麥加工過程中的主要農副產品，富含粗蛋白、糖分（麥芽糖、淀粉等）和維生素。試驗采用麩皮作為碳源，用量為1，2，3，4，5 g，既為微生物發酵提供營養物質又實現了農副產品麩皮的充分利用。

干豆渣是豆制品加工生產過程中產生的副產品，其中大豆蛋白、脂肪等營養成分較豐富，可以為微生物合成含氮物質提供氮源，并且為菌體生長提供營養物質，實現干豆渣的有效利用，所以試驗用干豆渣作為氮源，用量為1，2，3，4，5 g。

無機鹽作為培養基中微生物生長的營養物質之一，維持好食脈孢菌和紅酵母的生長和新陳代謝，所以試驗選擇無機鹽MgSO4加入到培養基中，單因素Mg2+添加量為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%。

1.3.2 發酵產物處理及產量計算

稱取空白組秸稈粉均勻鋪在培養皿中，再稱取3份相同質量的試驗組秸稈粉于培養皿中，將4份培養皿放入45℃恒溫干燥器內，干燥至恒質量。

將干燥結束的培養皿取出，準確稱取1 g干燥的秸稈粉和1 g石英放入研缽內研磨至粉碎，將粉碎后的秸稈粉末放入錐形瓶中，并加入15 mL丙酮，蓋緊，放至振蕩器內振蕩35 min。振蕩后取出，吸取其中的液體于離心管內，然后將離心管放入離心機中離心15 min。離心結束后，吸取離心管內上清液于比色皿中，用未接好食脈孢菌和紅酵母菌的秸稈培養基作為對照，于波長460 nm處測定吸光度，根據計算公式得出類胡蘿卜素的質量，并記錄數據。

式中：B——單位質量發酵玉米秸稈中類胡蘿卜素質量，μg/g；

Aλmax——最大吸收波長460 nm處的吸光度；

D——測定試樣的稀釋倍數；

V——提取類胡蘿卜素所用丙酮溶劑體積，mL；

m——干玉米秸稈的質量，g；

0.16——類胡蘿卜素的摩爾消光系數。

2 結果與分析

2.1 培養基條件優化

2.1.1 培養基初始pH值對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培養基水含量為55%，調節培養基pH值分別為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在32℃下恒溫培養96 h后，測定培養基初始pH值對類胡蘿卜素產量的影響。

pH值對胡蘿卜素產量的影響見圖1。

圖1 pH值對胡蘿卜素產量的影響

由圖1可知，固態發酵培養基的初始pH值對好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈生產類胡蘿卜素有較大的影響，培養基pH值過高或過低時會降低微生物細胞對環境中營養成分的吸取能力或抑制菌體中某些酶的活性甚至導致其死亡[13]，從而使類胡蘿卜素產量降低，在微酸的培養環境中類胡蘿卜素產量較高，當培養基初始pH值約為5.5時是好食脈孢菌和紅酵母發酵的最適生長pH值和最適生產pH值，類胡蘿卜素產量最高，當pH值大于5.5后，pH值抑制菌體酶的活性，破壞微生物生化體系中各種生化反應的協調一致性，從而影響微生物細胞內的新陳代謝，導致其不能正常發酵秸稈，使類胡蘿卜素產量降低。

2.1.2 水添加量對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培養基水添加量為55%，調節培養基pH值約為6，加入蒸餾水使培養基的水添加量分別為50%，55%，60%，65%，70%，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在28℃恒溫培養箱中培養96 h后，測定不同培養基水添加量下對類胡蘿卜素產量的影響。

水添加量對胡蘿卜素產量的影響見圖2。

圖2 水添加量對胡蘿卜素產量的影響

由圖2可知，固態發酵培養基水添加量對好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈有影響。水分是大部分微生物生長所必需的成分，好食脈孢菌和紅酵母的生長繁殖及類胡蘿卜素的形成都需要適宜的水分，對固態發酵培養基中水添加量的控制至關重要[14]。當培養基水添加小于60%時，水添加量較低使酶的活性受到抑制導致微生物生長不良，當培養基水添加量大于60%時會降低基質的疏松度，阻礙氧氣的傳遞，影響好食脈孢菌和紅酵母正常繁殖代謝，減弱了好食脈孢菌纖維素酶活性，使菌株不能正常分解秸稈，導致類胡蘿卜素產量迅速降低。

2.1.3 碳源用量對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，分別加入麩皮1，2，3，4，5 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培養基水添加量為55%，調節培養基pH值約5.5，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在28℃恒溫培養箱中培養96 h后，測定不同麩皮用量對類胡蘿卜素產量的影響。

碳源用量對胡蘿卜素產量的影響見圖3。

圖3 碳源用量對胡蘿卜素產量的影響

由圖3可知，麩皮作為培養基的碳源成分，其用量過多或過少對類胡蘿卜素的產量都有影響。當麩皮用量過少時培養基中的營養成分不充足，不能滿足菌體的正常生長，使相關酶不能發揮作用；當麩皮用量過多時，霉菌菌絲生長旺盛，孢子產量降低，相當于發揮作用的菌株減少，從而導致類胡蘿卜素產量降低，由圖3可知麩皮最適用量為4 g。

2.1.4 氮源用量對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮2 g，分別加入干豆渣1，2，3，4，5 g，Mg2+添加量0.2%，培養基水添加量為55%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在28℃培養箱中培養96 h后，測定不同干豆渣用量對類胡蘿卜素產量的影響。

氮源用量對胡蘿卜素產量的影響見圖4。

圖4 氮源用量對胡蘿卜素產量的影響

由圖4可知，當干豆渣用量小于2 g時，有利于好食脈孢菌和紅酵母的利用，有利于代謝產物的形成，當干豆渣用量大于2 g時，類胡蘿卜素產量反而逐漸降低。由于干豆渣中的蛋白質等營養成分較為豐富，加入過多干豆渣使培養基中氮含量增加，霉菌生長旺盛，好食脈孢菌和紅酵母生長的相關酶受到抑制作用，因此類胡蘿卜素產量降低。

2.1.5 Mg2+添加量對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，培養基水添加量為55%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在28℃的恒溫培養箱中培養96 h后，測定Mg2+添加量對類胡蘿卜素產量的影響。

Mg2+添加量對胡蘿卜素產量的影響見圖5。

圖5 Mg2+添加量對胡蘿卜素產量的影響

由圖5可知，Mg2+添加量對好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈的類胡蘿卜素產量有一定影響。一定量的K+、Mg2+、Na+、Ca2+對類胡蘿卜素產量有促進的作用[13]。馬歌麗等人[14]在紅酵母發酵生產β-類胡蘿卜素培養基配方研究中得出適量的MgSO4能促進類胡蘿卜素的積累；Mg2+對食脈孢霉固態發酵麩皮產類胡蘿卜素有較強的促進作用[15]；當MgSO4添加量小于0.4%時，類胡蘿卜素產量逐漸增加，因為在細胞生長過程中，Mg2+對細胞分裂和糖降解酶的活性有促進作用[16]。當Mg2+添加量為0.2%～0.4%時，類胡蘿卜素產量與其呈正比關系，添加量為0.4%時類胡蘿卜素產量最高。當添加量大于0.4%后，培養基環境的滲透壓增高會降低酶的活性，使好食脈孢菌降解粗纖維能力下降，紅酵母的生物活性也受到影響，從而導致類胡蘿卜素產量降低。

2.1.6 培養基初始裝量對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮2 g，干豆渣2 g，Mg2+添加量0.2%，培養基水添加量為55%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），培養基裝量分別為12.5，13.0，13.5，14.0，14.5 g/mL，在28℃恒溫培養箱中培養96 h后，測定不同培養基初始裝量對類胡蘿卜素產量的影響。

培養基裝量對胡蘿卜素產量的影響見圖6。

圖6 培養基裝量對胡蘿卜素產量的影響

由圖6可知，類胡蘿卜素的產量易受裝瓶量的影響，好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈需要氧氣，裝瓶量主要影響培養基的溶氧量和營養成分含量，當培養基裝量為12.5 g/250 mL時，類胡蘿卜素產量最高，當裝瓶量過少時，培養基中營養成分相對過少，不能滿足好食脈孢菌和紅酵母的正常生長繁殖；當裝瓶量過大時，培養基中的溶氧量相對減少，從而抑制好食脈孢菌和紅酵母正常代謝，使好食脈孢菌的纖維素酶活性降低，因此類胡蘿卜素產量降低。

2.1.7 正交試驗

以培養基水添加量（A）、麩皮用量（B）、干豆渣用量（C）、MgSO4添加量（D）為影響因素，以固態發酵后類胡蘿卜素的產量為指標，在秸稈添加10 g，裝量為12.5 g/250 mL，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），發酵溫度28℃，發酵時間96 h的條件下，設計正交試驗。

L9（34）正交因素與水平設計見表1，L9（34）正交試驗結果見表2。

表1 L9（34）正交因素與水平設計

表2 L9（34）正交試驗結果

由表2可知，4個因素對累胡蘿卜素產量影響程度從大到小依次為C>A>D>B，即干豆渣用量>培養莖水添加量>MgSO4添加量>麩皮用量，最優水平為C2B3A2D2，即干豆渣用量3 g，麩皮用量4 g，水添加量60%，MgSO4添加量0.4%，此條件下的發酵試驗測的類胡蘿卜素產量為224.75μg/g。

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 接菌比例對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培養基水添加量為60%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%，接菌比例分別為好食脈孢霉∶紅酵母=2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，在28℃的恒溫培養箱中培養96 h后，測定不同比例接種量對類胡蘿卜素產量的影響。

接種比對胡蘿卜素產量的影響見圖7。

圖7 接種比對胡蘿卜素產量的影響

由圖7可知，不同比例的接種量對類胡蘿卜素產量有一定影響，好食脈孢菌可以降解玉米秸稈中的粗纖維，當好食脈孢菌含量較低時玉米秸稈中的粗纖維很難被充分降解，使固態發酵程度不徹底從而影響類胡蘿卜素的產量，當紅酵母的接種量過低時，使紅酵母發酵玉米秸稈產類胡蘿卜素效果不明顯，當2種菌的接種比例為1∶1時，好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈效果顯著明顯可以使類胡蘿卜素產量提高。

2.2.2 培養溫度對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培養基水添加量為60%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%（好食脈孢霉∶紅酵母=1∶1）分別在24，28，32，36，40℃的恒溫培養箱中培養96 h后，測定不同培養溫度對類胡蘿卜素產量的影響。

培養溫度對胡蘿卜素產量的影響見圖8。

圖8 培養溫度對胡蘿卜素產量的影響

由圖8可知，溫度在24～28℃時，類胡蘿卜素的產量與溫度呈正比關系，且在28℃時類胡蘿卜素產量最高，但在28℃時類胡蘿卜素產量下降明顯且呈逐漸下降的趨勢，因此可知，好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈時，最適溫度一般在28℃左右，適宜的溫度有利于微生物的生長繁殖和產物的合成，但過高會使微生物活性降低甚至死亡，導致相關酶的活力降低或喪失，使類胡蘿卜素產量降低。

2.2.3 培養時間對類胡蘿卜素產量的影響

向250 mL錐形瓶中加入秸稈粉10 g，麩皮4 g，干豆渣3 g，Mg2+添加量0.4%，培養基水添加量為60%，調節培養基pH值約為5.5，接種量為20%（好食脈孢霉∶紅酵母=1∶1）在28℃的恒溫培養箱中分別培養24，48，72，96，120 h后，測定不同培養時間對類胡蘿卜素產量的影響。

培養時間對胡蘿卜素產量的影響見圖9。

由圖9可知，在整個培養過程中，類胡蘿卜素的產量呈上升趨勢，在72～96 h時，類胡蘿卜素產量增加速度最快，96 h后類胡蘿卜素產量緩慢增加，這是因為隨著發酵的進行，培養基中的營養物質逐漸被消耗，能為好食脈孢菌和紅酵母提供的營養物質越來越少而導致其代謝緩慢，以至于類胡蘿卜素生產的速率大幅降低，所以在發酵96 h后培養時間對類胡蘿卜素產量影響不大。

圖9 培養時間對胡蘿卜素產量的影響

3 結論

對好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈產類胡蘿卜素的培養條件進行了研究。通過單因素試驗和正交試驗表明，250 mL錐形瓶中加入秸稈10 g，麩皮4 g，干豆渣3 g，MgSO4添加量為0.4%，培養基初始pH值約為5.5，培養基含水量為60%，接種量為20%（好食脈孢菌∶紅酵母=1∶1），在28℃恒溫培養96 h，類胡蘿卜素產量達到224.75μg/g。試驗優化提高了好食脈孢菌和紅酵母協同固態發酵秸稈的類胡蘿卜素產量。

通過對好食脈孢菌和紅酵母協同發酵秸稈前后狀態的比較，發酵后的秸稈質地柔軟且色澤金黃，有微微的醇香味，可以初步判斷在發酵過程中產生了乙醇，為生產含有天然類胡蘿卜素的功能性飼料奠定了基礎。