賈躍進常用治療失眠障礙藥對的作用機制分析*

彭雪峰，劉毅，趙飛，王瑞敏，張譯心，李菲，陳艷清，賈躍進

1 山西中醫藥大學 山西太原 030024

2 山西中醫藥大學附屬醫院 山西太原 030024

失眠障礙（Ⅰnsomnia Disorder，ⅠD）是最常見的一種疾病，其表現以入睡困難、頻繁覺醒或無法再眠，并且伴隨日間功能障礙為特征，是許多精神、軀體疾病的危險因素。[1-2]但鑒于目前西藥的治療中存在一些令人擔憂的副作用和安全隱患，而中藥則相對副作用小，療效明顯，存在一定優勢[1-3]。因此挖掘中藥可對失眠癥的藥物治療提供思路和參考。

賈躍進主任醫師是第六批全國老中醫藥專家學術經驗繼承工作室指導老師，臨證40余年，尤擅應用中藥治療包括失眠癥在內的多種神經、精神疾病。曾師從國醫大師呂景山，繼承其對藥調治疾病的學術思想，臨床用藥往往在辨證論治的基礎上，活用對藥治療各種疾病，常以菖蒲-郁金（CP-YJ）、丹參-元胡（DS-YH）、黃連-梔子（HL-ZZ）、酸棗仁-柏子仁（SZR-BZR）、百合-地黃（BH-DH）5個藥對配合使用治療失眠癥，取得了較好的療效。故本文根據中藥多成分、多靶點、多通路的復雜網絡特性選取網絡藥理學方法研究該5個藥對，以期為臨床使用及進一步研究提供一定思路。

資料與方法

1 各藥對活性成分與靶點搜集

利 用TCMSP數 據 庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）（檢索關鍵詞：Herb Name分別是：郁金、丹參、元胡、黃連、梔子、酸棗仁、柏子仁、百合、地黃）檢索所有藥對中藥物的活性成分，按照OB（oral bioavailability）≥30%，BBB（blood brain barrier）≥-0.3，DL（drug—likeness）≥0.18進行篩選，并根據中國知網（https：//www.cnki.net/）相關藥物文獻（檢索關鍵詞為：SU=菖蒲 OR 化學成分）最終確定藥物中確有作用的活性成分，然后結合TCMSP與Swisstargetprediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得出藥物各活性成分的作用靶點，在Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2 疾病靶點與藥對-疾病交集靶點搜集

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMⅠM（https：//omim.org/#）數據庫中檢索“insomnia disorder”以搜集疾病靶點，篩選后匹配Uniprot數據庫中的基因名。然后利用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）確定各藥對與疾病的交集靶點，并繪制Venn圖。

3 疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡和蛋白互作關系（PPⅠ）網絡構建

以疾病、藥對、藥物、活性成分和靶點為節點，其相互關系為邊，在CytoscapeV3.6.1中構建網絡。同時將5個藥對與疾病的交集靶點分別導入String數據庫（https：//string-db.org/）限定物種為智人，并利用Cytoscape軟件構建PPⅠ網絡，利用內置MCODE插件及網絡分析功能限定節點度值篩選PPⅠ網絡核心靶點。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

在Metascape（https：//metascape.org/）數據庫平臺中導入1.2中5類交集靶點并分別進行GO生物過程、分子功能及細胞成分富集分析和KEGG通路富集分析，然后利用在線作圖平臺微生信平臺及ⅠmageGP（http：//www.ehbio.com/ⅠmageGP/）繪制GO富集條形圖及KEGG通路富集氣泡圖。

5 核心成分和核心靶點分子對接驗證

取疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡中節點度＞2倍中位數的核心有效成分和核心PPⅠ網絡中節點度大于中位數的核心靶點，利用PDB（http：//www.rcsb.org/）及Zinc（http：//zinc.docking.org/）數據庫分別獲得核心靶點和核心成分的3D結構，預處理后應用Autodock vina分子對接，并在Pymol中可視化結果。

結 果

1 藥對活性成分、相關靶點搜集結果

通過檢索TCMSP數據庫、查閱中國知網，并限定OB、BBB、DL值篩選活性成分，其結果如表1所示。其中菖蒲-郁金、丹參-元胡、黃連-梔子、酸棗仁-柏子仁、百合-地黃活性成分各13、93、24、17、10種，而5個藥對分別匹配得相關靶點各：351、230、176、166、166個。

表1 各藥對主要活性成分基本信息

2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結果

在GeneCards、OMⅠM數據庫中檢索失眠癥靶點，將其合并去重后，共得到失眠癥靶點994個。將1.1中5個藥對靶點分別與其取交集，如圖1，得到交集靶點分別：89、67、49、44、52個。

圖1 藥對-疾病交集靶點

3 疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡和PPⅠ網絡構建結果

疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡構建結果如圖2所示，圖中包含772個節點，3167條邊。利用Cytoscape分析網絡，計算節點度，篩選網絡中節點度＞2倍中位數的核心成分。然后將2.2中藥對-疾病交集靶點分別導入String數據庫，得出以靶點為節點，蛋白相互作用為邊的5個網絡，并利用Cytoscape內置的MCODE插件以及網絡分析功能篩選各網絡中的核心網絡以及節點度大于中位數的核心靶點，核心網絡見圖3。最后得到菖蒲-郁金藥對核心成分為：CP4、CP3、YJ3、YJ4、YJ6、YJ7及A，核心靶點為：DRD2、HTR2C、OPRM1、DRD4、ADRA1A、HTR5A；丹參-元胡藥對核心成分為：DS6、DS42、DS43、D、H，核心靶點為：DRD2、FOS、SLC6A4、MAOA、CRH、ACHE、HTR3A；黃連-梔 子的 核 心 成 分為：ZZ1、ZZ6、A、D、H，核心靶點為：FOS、VEGFA、ⅠL6、ⅠL1B、MMP2、MMP9；酸棗仁-柏子仁的核心成分為：SZR5、BZR1，核 心 靶 點 為：ADRA1A、APP、GRM5、CASR；百合-地黃的核心成分為：BH3、A、D，核心靶點為：OPRM1、ADRA1A、APP、ADRA2A、ADRA2C、F2。

圖2 疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡

圖3 PPⅠ網絡圖

4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結果

將疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結果中所得5類交集靶點導入Metascape進行GO和KEGG通路富集分析，其中菖蒲-郁金—失眠癥的GO富集分析共得1296條結果，包括突觸信號、調節神經遞質水平、節律過程、GABA能的突觸傳遞等生物過程，神經遞質受體活性、G蛋白偶聯的胺受體活性、激素結合等細胞功能，以及枝晶、突觸膜、膜筏等細胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得89條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、血清素能突觸、晝夜節律等通路；丹參-元胡—失眠癥的GO富集分析共得1062條結果，包括行為、化學突觸傳遞、調節神經遞質水平、單胺運輸、GABA能的突觸傳遞等生物過程，神經遞質受體活性、腎上腺素受體活性、類固醇結合等分子功能，以及突觸膜、GABA-A受體復合物、軸突等細胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得49條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸、血清素能突觸等通路；黃連-梔子—失眠癥的GO富集分析共得828條結果，包括循環系統中的血管過程、化學突觸傳遞、調節神經遞質水平等生物過程，腎上腺素受體活性，神經遞質受體活性、類固醇結合等分子功能，以及突觸前膜、膜筏等細胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得63條通路，包括神經活性配體-受體相互作用、TNF信號通路、多巴胺能突觸等通路；酸棗仁-柏子仁—失眠癥的GO富集分析共得690條結果，包括行為、MAPK級聯反應的調控、單胺運輸等生物過程，腎上腺素受體活性、單胺跨膜轉運蛋白活性、神經遞質受體活性等分子功能，以及膜筏、突觸后膜的組成部分等細胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得38條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、血清素能突觸等通路；百合-地黃—失眠癥的GO富集分析共得755條結果，包括行為、細胞分泌調節、晝夜節律的調節等生物過程，神經遞質受體活性、腎上腺素受體活性等分子功能，以及突觸后膜、GABA-A受體復合物等細胞成分，此外KEGG通路富集分析獲得41條通路，包括：神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸等通路。然后篩選p值＜0.01，最小計數為3，富集因子＞1.5的富集項，分別繪制GO富集結果圖和KEGG富集氣泡圖，如圖4、5。然后分別以交集靶點、通路、疾病及各藥對為節點，其相互關系為邊構建網絡，以直觀表明四者關聯，如圖6，其中神經活性配體-受體相互作用通路的基因比、基因計數及q值都較大程度比其他通路高，因此可認為該5對藥對均最可能藉由此通路對失眠癥作用。

圖4 GO富集分析結果

圖6 疾病-靶點-通路關系圖

5 核心成分與核心靶點分子對接結果

疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集結果中篩選得到的核心成分與核心靶點對接結果皆小于-5 kcal·mol-1，可見所有核心成分與核心靶點的組合都可形成穩定結構，結果如表2。再取與每個藥對對接最穩定的組合運用Pymol對其構象可視化，其中灰色部分為靶點，綠色部分為成分分子，其余各色標記殘基，并顯示名稱，黃色虛線為氫鍵，并標距離，見圖7。

表2 核心活性成分與核心靶點分子對接結果

圖7 對接較好的核心成分與核心靶點的分子對接構象

討 論

失眠癥，中醫稱之為“不寐”。《靈樞》云：“夫衛氣者，晝日常行于陽，夜行于陰，故陽氣盡則臥，陰氣盡則窹”。[4]確立了“陽不入陰，陰陽失交”的總病機，賈躍進老中醫結合其總病機以及朱丹溪的“六郁”學說，從而認為氣、血、痰、火、濕、食等“郁”壅塞氣道，阻遏氣機，以致營衛失合，陽不入陰，則發為不寐，并將“調氣”作為治療不寐的大法，并常以化痰安神的菖蒲-郁金、活血安神的丹參-元胡、清心安神的黃連-梔子、養血安神的酸棗仁-柏子仁、養陰安神的百合-地黃配合疏肝行氣解郁的方劑從“郁”論治不寐。現代藥理學研究亦表明這些藥物均可在抗抑郁、抗焦慮、鎮靜催眠、腦保護等方面發揮作用[5-11]。所以該5個藥對從中醫理論和現代研究來看，確可治療失眠癥。而在賈師實際應用中亦效如桴鼓，切有較多的驗案與經驗類文獻對其療效與應用進行了報道[12]。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

根據本文構建的疾病-藥對-藥物-成分-靶點網絡所得的核心活性成分來看，CP3、CP4是來自CP中的揮發油類，對其大量研究證實其存在抗焦慮、抗抑郁、抗癲癇、神經保護等廣泛神經系統作用，動物實驗亦證實其可增加γ-氨基丁酸（GABA）受體陽性變構調節劑誘導的小鼠睡眠時間[13]；YJ3、YJ4、YJ6、YJ7屬于郁金的揮發油成分，該類成分在動物實驗中被報道可顯著改善小鼠的工作記憶和空間學習記憶能力[14]；DS6可以通過激活ERK和GSK-3β信號來減輕低膽堿能神經傳遞引起的認知障礙[15]；DS43是DS中的三萜類物質，其被報道具有多方面的神經保護作用，如可通過p-p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和血管內皮生長因子（VEGF）減弱新生大鼠的神經炎癥，以及抑制小膠質細胞活化和減少NADPH氧化酶和iNOS的表達來發揮神經保護作用[16-17]；ZZ1是一種五環三萜，被認為在中樞神經系統（CNS）的一些疾病中具有治療潛力，包括：認知障礙、抑郁、焦慮等[18]；ZZ6則被認為存在抗炎的作用，而其作用可能與組胺，5-羥色胺（5-HT），激肽和前列腺素的釋放有關[19]；SZR5是酸棗仁的主要活性成分，可調節GABA受體亞基mRNA的表達，下調腸粘膜系統相關炎癥細胞因子的分泌，而影響大腦神經細胞之間的細胞間細胞因子網絡以發揮其鎮靜催眠作用[20]；BZR1屬于花生酸，該物質在神經系統中有重要作用，包括睡眠誘導，增強空間學習和突觸可塑性以及抗炎和神經保護等[21]；D、A、H是藥物共有的成分，可見藥對之間存在一定的協同作用，其中成分D在動物實驗中被驗證可上調谷胱甘肽、GABA水平，下調多巴胺（DA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、乙酰膽堿酯酶（AChE）等的水平調節精神癥狀、改善腦功能[22]；成分A則可抑制TNF-α而發揮神經保護作用，而動物實驗亦驗證其可增加小鼠CNS中的去甲腎上腺素（NE），5-HT等神經遞質而表現抗抑郁活性[23-24]。

通過PPⅠ網絡得出的核心靶點，其中OPRM1、DRD2、DRD4、ADRA1A、ADRA2A、ADRA2C、HTR3A、HTR5A、HTR2C、SLC6A4、MAOA、ACHE、CRH編碼的蛋白參與調控涉及E、NE、DA、5-HT、ACh等神經遞質，而這些神經遞質是已知的調控睡眠-覺醒的關鍵物質[25]；ⅠL6、ⅠL1B所編碼的蛋白則參免疫調節，其中促炎性細胞因子ⅠL-1，ⅠL-6會增加非快速眼動睡眠，而消炎性細胞因子ⅠL-4、ⅠL-10會降低睡眠時間[26]；MMP2、MMP9編碼基質金屬蛋白酶，這類蛋白酶已被證明在大腦的許多生理和病理過程中起著至關重要的作用，特別是在一些學習和記憶過程及主要的神經精神疾病中，例如精神分裂癥，癲癇癥和抑郁癥等[27]；VEGFA在研究中被表明可影響GABA能神經元的發育[28]；FOS則被認為與覺醒相關[29]；APP在睡眠中斷時會增加表達，從而增加阿爾茨海默癥的風險[30]；GRM5編碼谷氨酸的G蛋白偶聯受體，在調節突觸可塑性和調節神經網絡活動中起重要作用[31]。

總體來看GO富集分析所獲得的主要生物過程與KEGG通路富集分析得到的主要通路都分別集中在調節神經遞質水平、化學突觸傳遞、行為、晝夜節律調節等生物過程以及神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、膽堿能突觸等通路，可以看出這些藥對的主要機制應是通過DA、5-HT、ACh等神經遞質調節的，與目前睡眠的神經生理機制相吻合。而就分子對接結果來看，所有核心成分與核心靶點均能形成穩定結構，可一定程度驗證網絡藥理學結果。

綜上所述，根據中醫理論、網絡藥理學研究及分子對接驗證，可初步揭示賈躍進老中醫治療失眠癥的常用藥對的核心成分和核心靶點以及其主要作用機制，所得結論可為進一步研究和臨床的使用提供一定參考和依據。