外環(huán)境中ASFV核酸檢出情況及分析

王久紅

（湖北金林原種畜牧有限公司，武漢 430200）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是世界動物衛(wèi)生組織通報的重大動物疫病，它是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬引起的1 種急性、廣泛出血性的烈性傳染病，給世界生豬產(chǎn)業(yè)帶來了極大損失，我國已將其列為第一類動物疫?。?，2］。自沈陽于2018年8月首次發(fā)現(xiàn)ASF以來［3］，其他省份也陸續(xù)暴發(fā)該病。目前非洲豬瘟疫情仍在持續(xù)，防控形勢依然復(fù)雜嚴(yán)峻。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部報道，2021 年以來，全球有18 個國家和地區(qū)共發(fā)生4 120 起非洲豬瘟疫情。而且隨著ASFV 弱毒株出現(xiàn)，給養(yǎng)豬企業(yè)ASFV 防控提出了更高要求［4，5］，沒有感染ASFV 的養(yǎng)殖企業(yè)（戶）應(yīng)嚴(yán)防外部輸入，防控工作不可松懈。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年至2021年上半年，按照農(nóng)業(yè)部推薦標(biāo)準(zhǔn)NY/T 541—2016，在湖北金林原種畜牧有限公司采集外來車輛、人員以及購進(jìn)物資等樣品共3 778 份，其中車輛樣品552 份（外來生豬運(yùn)輸車輛環(huán)境樣品163份，外出售豬車輛樣品16份，外出接送人員車輛樣品66 份，其他車輛樣品307 份），人員樣品2 278份，物資樣品948份。

1.2 試劑

ASFV 熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑盒，美國愛德士試劑公司；病毒RNA/DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

A2型生物安全柜，購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；TGuideS32 核酸提取儀，購自天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量PCR 儀，購自西安天隆科技有限公司；高壓滅菌鍋，購自上海申安醫(yī)療器械廠。

1.4 樣品處理和檢測

將采集的樣品置于EP 管中浸泡20 min 后渦旋20 s，使棉簽或紗布上沾附的樣品充分脫落，之后靜置10 min，瞬時離心待核酸提取；當(dāng)EP 管中上層懸浮液中有較多顆粒時，需1 000 r/min 離心30 s 后進(jìn)行核酸提取。按照天根磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取核酸。按照美國愛德士非洲豬瘟熒光定量PCR 試劑盒操作說明書進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增和結(jié)果判定。按農(nóng)業(yè)部推薦標(biāo)準(zhǔn)NY/T541—2016進(jìn)行廢棄物處理。

2 結(jié)果與分析

所有樣品ASFV 核酸檢測結(jié)果見表1。由表1可知，在采集的3 778 份樣品中，有43 份檢測出ASFV 核酸陽性，總體陽性率為1.14%；車輛、人員和物資的樣品陽性率分別為4.53%（25/552）、0.53%（12/2 278）和0.63%（6/948）。通過對12 個ASFV 核酸檢測陽性人員調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些人員之前均去過菜市場或集貿(mào)市場；而且在6 份ASFV 核酸檢測陽性物資中，3 份物資樣品是來自于菜市場或集貿(mào)市場，這表明作為供應(yīng)豬肉和豬肉制品的菜市場或集貿(mào)市場可能已經(jīng)受到ASFV的污染。

表1 3種不同類型環(huán)境樣品中ASFV核酸檢測結(jié)果

由表2 可見，在車輛樣品中，外出售豬車和外出接送人員車的ASFV核酸陽性率分別為6.25%（1/16）和3.03%（2/66）；外來運(yùn)豬車陽性率最高，為13.50%。

表2 不同用途的車輛樣品中ASFV核酸檢出情況

3 小結(jié)與討論

ASF對我國生豬養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是我國當(dāng)前重點(diǎn)防疫的疾病之一［5］。ASFV傳播途徑多、在環(huán)境中很穩(wěn)定，導(dǎo)致其防控困難，隨著ASFV 弱毒株的出現(xiàn)，更增加了其防控難度［6］。ASFV 主要通過接觸傳播，受ASFV 污染的運(yùn)輸車輛、物資及工作人員可通過接觸感染健康豬只。據(jù)報道，通過運(yùn)輸車輛或人員傳染ASFV 的風(fēng)險很高［7］，生豬運(yùn)輸車輛是ASFV 擴(kuò)散的主要風(fēng)險因素［3］。當(dāng)空氣中ASFV 病毒量足夠高時，也可以進(jìn)行傳播［8］。

本研究利用高靈敏度熒光定量PCR 方法，對湖北金林原種畜牧有限公司人員、購進(jìn)物資和外出車輛采集的3 778 份樣品進(jìn)行ASFV 核酸檢測，結(jié)果表明，這3 類樣品不同程度攜帶ASFV，均是豬場感染ASFV 的潛在風(fēng)險因素。因此，養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)提高檢測靈敏度并加強(qiáng)環(huán)境檢測頻率，嚴(yán)格把控車輛、人員及物資的進(jìn)出；養(yǎng)殖場從業(yè)人員也應(yīng)提高生物安全意識，平時做好消毒工作，出場休假時非必要不出入高風(fēng)險地域。

在3 種不同類型樣品中，車輛特別是外來生豬運(yùn)輸車輛攜帶ASFV 的幾率很高，ASFV 核酸檢出率高達(dá)13.50%，可能因?yàn)榍捌谪i價較高，運(yùn)豬車輛全國各地進(jìn)行買賣，車輛所經(jīng)環(huán)境復(fù)雜，再加之車輛洗消不徹底，致使ASFV 在運(yùn)輸車輛中長期存活，繼而導(dǎo)致疫情傳播。因此，養(yǎng)殖場應(yīng)重視生豬運(yùn)輸車輛的潛在風(fēng)險，在加強(qiáng)檢測的同時加強(qiáng)車輛的洗消和烘烤，有效切斷傳播途徑。在無有效疫苗和治療藥物的情況下，嚴(yán)防ASFV輸入豬場是首要目標(biāo)［9］。