丹參多酚酸通過SIRT1/HMGB1路徑改善大鼠腦缺血/再灌注損傷的機制研究

曹自為， 張 嶸， 李 蒙， 管葉明， 汪青松

目前在全球范圍內，卒中現已成為人類死亡的第二大常見病因，而在我國該疾病的致死及致殘率已攀升到了第一位。雖然急診溶栓、介入治療獲得了快速發展，其能使患者快速恢復血供，改善缺血所致的腦損傷。但是由于介入治療技術有較高的要求，急診溶栓的時間窗較短，并不能得到的廣泛的應用，因此，尋找改善缺血性腦損傷的有效藥物，改善腦梗死患者的預后，具有非常重要的社會價值。

丹參作為最古老的中藥之一，最早是用于治療出血性疾病如(月經出血)和血瘀方面的疾病，其中最活躍的有效成分之一是丹參多酚酸(包括丹參酮、丹酚酸B等活性成分)[1]。Zeng等[2]的研究驗證了丹參多酚酸能通過SIRT1通路抑制HMGB1的表達，阻斷下游炎癥通路，及其炎癥因子如NF-κB，白細胞介素(inter-leukin，IL)-1β的表達，對高脂肪食物和棕櫚酸誘導的肝脂肪變性和炎癥提供保護。因此我們推測：丹參多酚酸是否可以通過SIRT1-HMGB1路徑，抑制P-53、NF-κB的表達，從而發揮抗炎作用，進而改善腦缺血/再灌注損傷。本研究通過腹腔注射丹參多酚酸及SIRT1抑制劑(selisistat，EX-527)至大腦中動脈栓塞模型大鼠，動態監測大鼠靜脈血以及腦組織中 SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB的表達、以及神經細胞凋亡指數的改變，探討丹參多酚酸改善大鼠缺血性腦損傷的具體保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇普通級健康雄性SD大鼠132只，體質量250～300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，安徽醫科大學實驗動物中心飼養，均通過動物實驗管理辦法和倫理論證。采用干濕分離飼養籠，自然光照，自由進食，7 d后實驗。實驗前所有大鼠隨機分為4組：假手術(Sham)組、模型(IS)組、丹參多酚酸(SA)組、SIRT1抑制劑EX527(EX527)組，每組 33只。

1.2 鼠大腦中動脈梗塞模型建立 Sham組大鼠僅單純分離血管，其余三組采用改良線栓法[3]構建大鼠右側大腦中動脈栓塞模型。缺血1 h后拔出線栓，術中及術后用暖光燈照射大鼠肛門部，保持動物體溫 (37±0.5) ℃。在整個實驗階段內出現死亡、昏迷及抽搐的大鼠均被棄去。模型成功的標準：從尾部將大鼠提起，保持懸空，轉頸超過10°，左前肢屈曲內收，同時伴肌張力下降，活動時呈典型追尾征，若無上述典型癥狀予以剔除。丹參多酚酸(天津天士力子嬌藥業有限公司)和SIRT1特異性抑制劑EX527溶于5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，丹參多酚酸組分別于手術前1 h按照100 mg /kg經腹腔注入丹參多酚酸，EX527組遵照相同時間點按5 mg/kg經腹腔注入。

1.3 神經功能缺損評分 采用改良神經損傷嚴重程度評分(modified Neurological Severity Scores，mNSS) 量表[4]分別于再灌注后 1 d、3 d、7 d各時間點進行神經功能缺損評分。

1.4 RT-PCR檢測梗死灶周邊組織SIRT1、HMGB1mRNA的表達 取梗死灶周邊缺血腦組織約50～100 mg，剪碎，液氮研磨，在4 ℃環境下分別加入1 ml TRIzol、氯仿、異丙醇、DEPC水后離心，制備目的細胞總RNA，置于EP管中，并以該RNA為模板，在適當引物的存在下，由反轉錄酶生成cDNA。取出cDNA作為熒光定量的模板，經歷40次熱循環，擴增后收集熒光信號，采用相對量化研究分析數值。

1.5 Western blot法檢測梗死灶周邊組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB的表達 取梗死灶周邊腦組織約100 mg左右，加入RIPA細胞裂解液1 ml(內含1 mmol PMSF)進行裂解。4 ℃、12000 r/min離心15 min。收集含有組織總蛋白上清液，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至硝酸纖維膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。加入一抗后4 ℃緩慢搖動孵育過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，再洗滌，使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白，以β-actin為內參，北京科創銳新生物凝膠成像系統的分析系統進行膠片條帶的分析。

1.6 ELISA法檢測大鼠外周血p-53、NF-κB蛋白含量 各組大鼠分別于1 d、3 d、7 d從大鼠尾靜脈采血約3 ml置于含檸檬酸鈉的抗凝管中，混合10～20 min后，離心20 min左右(2000～3000 轉/min)，取上清液。后經標準操作溫育、洗滌、染色，最后參考空白孔在450 nm波長下依次測量每個孔的吸光度(OD值)。以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪制標準曲線，根據樣品的OD值從標準曲線中算出相應的濃度；再乘以稀釋倍數即為樣品試劑濃度。

1.7 TUNEL法測定缺血腦組織神經細胞凋亡指數 假手術組、模型組、丹參多酚酸組、抑制劑組各取10只大鼠分別于缺血再灌注1 d后取腦組織，制成厚度為2 mm石蠟切片，制作方法同HE染色。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)法，根據羅氏(Roche)公司Tunel試劑盒操作說明進行缺血海馬組織切片細胞凋亡的原位檢測，400倍光鏡下觀察。視野中凋亡細胞細胞核呈棕褐色為凋亡細胞，呈藍色為正常神細胞，每張切片于高倍視野下計數凋亡陽性細胞，以凋亡指數反映各組缺血區腦組織凋亡的情況，凋亡指數=(視野內凋亡細胞個數/視野內所有神經元細胞個數)×100%。

2 結 果

2.1 各時間點mNSS評分比較 Sham組mNSS評分在第1 d、3 d、7 d 3個時間點均為0分。與IS組和EX527組比，SA組mNSS評分明顯降低(F=8.318、9.483、14.596，P<0.01)見表1。

表1 各組不同時間段神經功能缺損評分比較

2.2 Western blot法檢測梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB蛋白表達結果 再灌注7 d時，SA組HMGB1、P-53、NF-κB蛋白表達均顯著低于IS組和EX527組，EX527組HMGB1、P-53、NF-κB蛋白的表達顯著低于IS組同時高于Sham組(F=1951.065、2038.176、4717.277，P<0.05)；SA組SIRT1蛋白表達量顯著高于IS組和EX527組，而EX527組SIRT1蛋白表達量又顯著高于Sham組和IS組(F=2614.746，P<0.05)，見圖1、圖2。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

圖2 7 d各組梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1、P-53、NF-κB蛋白的表達

2.3 RT-PCR法檢測梗死灶周邊腦組織SIRT1、HMGB1mRNA含量的結果 再灌注7 d時，SA組HMGB1mRNA表達均顯著低于Sham組、IS組和EX527組，EX527組HMGB1mRNA表達顯著高于Sham組的同時低于Sham組(F=199.523，P<0.05)；SA組SIRT1 mRNA表達量顯著高于Sham組、IS 組 和EX527組，EX527組SIRT1mRNA表達量顯著高于Sham組和IS組(F=485.729，P<0.05)，見圖3。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

2.4 ELISA法檢測大鼠外周血中P-53、NF-κB蛋白的濃度結果 再灌注7 d時，SA組大鼠外周血中P-53、NF-κB蛋白表達均顯著低于IS組和EX527組，EX527組P-53、NF-κB蛋白的表達顯著低于IS組同時高于Sham組(F=2409.562、2329.962，P<0.05)，見圖4。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

2.5 各組大鼠腦組織細胞凋亡指數比較 采用TUNEL法檢測在400倍光鏡加下觀測到大鼠腦組組織再灌注1 d后，IS組神經細胞凋亡指數明顯提高(P<0.05)。SA組神經細胞凋亡指數明顯低于IS組和EX527組(P<0.05)。EX527組凋亡指數要低于IS組(P<0.05)，見圖5。

*與SA組比較，P<0.05；#與EX527組比較，P<0.05

3 討 論

以往的一系列的研究表明SIRT1在缺血性腦損傷中起神經保護作用[5]。神經炎癥是一種在缺血后立即開始的破壞性反應[6]。促炎介質的主要轉錄因子是NF-κB，已有研究小組證實NF-κB的激活加劇了腦缺血后的神經損傷[7]。SIRT1使其p65亞基L以上Lys310的NF-κB脫乙酰化，降低其轉錄活性[8]。本實驗中我們主要發現高表達SIRT1蛋白的丹參多酚酸組其炎癥因子P-53、NF-κB的表達要明顯低于低表達SIRT1蛋白的模型組。但是抑制劑組在丹參多酚酸組的基礎上使用了SIRT1通路特異性阻斷劑EX-527后，其P-53、NF-κB的表達又出現較丹參多酚酸組升高的現象。說明SIRT1通路確實發揮了抑制炎癥反應的作用，與以往研究結論相符，而關于SIRT1在促進神經、基因修復；改善血流方面的作用未做進一步研究。

根據目前的研究，HMGB1 廣泛分布于哺乳動物細胞核中。細胞外，HMGB1 主要來源于細胞的主動和被動釋放，樹突狀細胞和巨噬細胞在受制于HMGB1，可被凋亡細胞、內毒素、腫瘤壞死因子或白介素等刺激后主動分泌。另外，細胞壞死及凋亡時可被動釋放HMGB-1/核小體復合物[9]。

胞外HMGB1與晚期糖基化終產物(advanced glycationend products，RAGE)結合，磷酸化絲裂原活化蛋白激酶，如p38 激酶、SAPK/TNK、ERK1 /2 等。通過激活信號轉導途徑，激活NF-κB通路，例如細胞分裂周期蛋白42、鳥苷三磷酸激酶、Janus 激酶。誘導多種細胞因子的產生，促進炎癥反應并參與免疫細胞遷移和表面受體表達[10～12]。HMGB-1與TLR2、TLR4結合激活 MyD88 依賴性 NF-κB 通路，促進 TNF、IL-1、IL-6等炎癥細胞因子表達和釋放[13，14]。HMGB1作為炎癥介質廣泛存在于所有細胞中，通過與RAGE和toll樣受體(toll-like receptors，TLR)2，TLR4和TLR9受體相互作用[15～17]，激活免疫活性細胞，對炎癥反應具有級聯放大作用。本實驗中，模型組1 d、3 d、7 d缺血腦組織中HMGB1蛋白或是mRNA的表達都較假手術組明顯提高。以上說明腦缺血后，HMGB1早期釋放，并促進了炎癥的進展。如何減輕炎性因子導致的“瀑 布 效 應”是挽救腦缺血缺血/再灌注所致神經細胞損傷的關鍵點。

丹參多酚酸同時具有改善微循環、抗炎、抗栓、抗氧化、清除自 由基、抑制內皮素釋放、改善器官缺血再灌注損傷等作用，藥理學機制的特點是在分子和細胞水平上有多個連接和多個靶點[17]，從我們的研究結果來看，丹參多酚酸組無論是缺血腦組織周邊SIRT1蛋白還是SIRT1 mRNA的表達從第一天開始就明顯較模型組和抑制劑組增加。同時丹參多酚酸組缺血腦組織周邊HMGB1、P-53、NF-κB蛋白和HMGB1、P-53、NF-κB mRNA的表達明顯較模型組和抑制劑組降低。抑制劑組使用了SIRT1特異性抑制劑EX-527后，無論是缺血腦組織周邊SIRT1蛋白還是SIRT1 mRNA的表達要高于模型組和假手術組，這可能是EX-527不完全阻斷丹參多酚酸的對SIRT1的激動作用有關，因此，抑制劑組缺血腦組織周邊HMGB1、P-53、NF-κB蛋白和HMGB1、P-53、NF-κB mRNA的表達在高于丹參多酚酸組的同時也要低于模型組。

以上結果說明丹參多酚酸可以通過促進SIRT1轉錄、抑制HMGB1遷移和表達，減少下游通路的炎癥因子P-53、NF-κB的釋放，同時抑制神經細胞凋亡，從而減輕大鼠大腦缺血/再灌注損傷。