長鏈非編碼RNA MEG3對成骨分化及骨性疾病影響的研究進(jìn)展

張軒銘，呂松岑

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)外科，黑龍江 哈爾濱 150086)

非編碼RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)是一類沒有編碼蛋白功能的RNA分子，根據(jù)它的大小，可分為小非編碼RNA和長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)。lncRNA是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，ncRNA的80%都是長鏈非編碼RNA。人們最初認(rèn)為lncRNA是轉(zhuǎn)錄的垃圾，但后來逐漸發(fā)現(xiàn)了lncRNA通過參與調(diào)控目的基因的表達(dá)，或者通過與啟動子和增強子相互作用，進(jìn)而對染色質(zhì)重構(gòu)、DNA甲基化、組蛋白修飾及RNA聚合酶的活性進(jìn)行調(diào)控，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化過程。母系表達(dá)的基因3(Maternally expressed gene3，MEG3)是母系表達(dá)的lncRNA，為一種位于染色體14q32的腫瘤抑制基因。MEG3通過抑制血管再生進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展，目前已經(jīng)了解到MEG3與多種腫瘤相關(guān)疾病、癌癥(如甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、各種炎癥反應(yīng)和心肌梗死等疾病的形成與發(fā)展存在著密切的關(guān)系。而MEG3在骨性疾病中的功能與作用機制的研究尚處于初步階段，但現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MEG3表達(dá)的上升或下降可調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化或?qū)е氯绻顷P(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤等多種骨性疾病的發(fā)生，這與MEG3/miR16/SMAD7、MEG3/miR203/Sirt1等多種通路軸有關(guān)。故MEG3的表達(dá)為后續(xù)研究骨性疾病提供了理論基礎(chǔ)，對骨性疾病診斷與治療均有一定的臨床意義。

1 MEG3調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化

在胚胎發(fā)育過程中，MEG3可能參與包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)在內(nèi)的多種細(xì)胞的分化過程。BMSCs是一種具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞分化潛能和自我更新能力的多能的間充質(zhì)干細(xì)胞。BMSCs分離方便、可參與免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)骨組織微環(huán)境、作為成骨細(xì)胞的主要來源，因此成為目前骨組織工程研究領(lǐng)域的理想細(xì)胞，為骨組織重建提供了更佳的治療方案[1]。

那么，MEG3是如何調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞等細(xì)胞分化的呢？Zhuang等[2]研究表明，MEG3通過阻止骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)啟動子區(qū)域中性別決定區(qū)域的抑制作用，促進(jìn)位于其下游數(shù)個Mbs處BMP4的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，進(jìn)而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤患者的人BMSCs向成骨細(xì)胞分化。Sun等[3]研究顯示，在糖尿病相關(guān)性勃起功能障礙的大鼠模型海綿體內(nèi)植入BMSCs，可以有效改善大鼠的勃起功能，同時海綿體組織中MEG3的表達(dá)顯著降低。而在體外，通過外源性血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化過程中，MEG3的表達(dá)也顯著下調(diào)。進(jìn)一步證實了MEG3的下調(diào)有利于BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。MEG3通過促進(jìn)叉頭盆蛋白質(zhì)M1(forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1)泛素化使FOXM1蛋白降解，從而降低血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞ECs分化。Li等[4]對48例骨折患者及30名健康體檢者的血清樣本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，骨折患者血清中的lncRNAMEG3的表達(dá)明顯升高，MEG3通過激活Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而激活成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與分化，因此，對MEG3的研究有望成為促進(jìn)骨折愈合的新靶點。以上研究表明，MEG3可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路和促進(jìn)FOXM1的泛素化與BMP4蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs與成骨細(xì)胞的分化。

Li等[5]實驗檢測到MEG3的表達(dá)在人脂肪來源干細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的成脂過程中下調(diào)，在其分化為成骨細(xì)胞的成骨過程中上調(diào)。而敲減MEG3可促進(jìn)人脂肪來源干細(xì)胞的成脂分化，抑制其成骨分化。相反地，miR-140-5p在成脂過程中上調(diào)，在成骨過程中下調(diào)，與MEG3呈負(fù)相關(guān)。因此，MEG3參與了人脂肪來源干細(xì)胞的成脂過程和成骨分化的過程，其機制可能與MEG3參與調(diào)節(jié)miR-140-5p的表達(dá)過程有關(guān)。Wang等[6]從去卵巢的小鼠病理模型和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者中分離培養(yǎng)BMSCs。實驗發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠和PMOP患者BMSCs中的MEG3和miR-133a-3p的表達(dá)都增加了，BMSCs中MEG3和miR-133a-3p的表達(dá)正相關(guān)。在BMSCs到成骨細(xì)胞的分化過程中，MEG3和miR-133a-3p的表達(dá)顯著降低，并且MEG3的過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)成骨分化過程所介導(dǎo)的miR-133a-3p的下調(diào)。從而得出結(jié)論，MEG3可通過上調(diào)miR-133a-3p抑制去卵巢小鼠和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs的成骨分化過程。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)與健康牙周膜組織相比，牙周炎牙周膜組織的MEG3與胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)表達(dá)下調(diào)，miR-27a-3p表達(dá)上調(diào)，存在著MEG3/IGF1/miR-27a-3p調(diào)控軸，過表達(dá)MEG3可通過增強IGF1的表達(dá)而抑制miR-27a-3p的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化，而上調(diào)miR-27a-3p的表達(dá)可抑制成骨分化。以上研究結(jié)果表明，存在MEG3-miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，MEG3是miRNA-140-5p、miR-133a-3p與miR-27a-3p的上游靶基因，MEG3可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控成骨細(xì)胞的分化過程。

2 MEG3與骨相關(guān)疾病

2.1 MEG3與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)關(guān)系 骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，在病理上可觀察到局部炎癥和滑膜炎等表現(xiàn)，早期患者可通過口服非甾體抗炎藥鎮(zhèn)痛或關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉緩解癥狀，晚期老年患者可通過關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療。但是，通過口服非甾體抗炎藥或關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉緩解癥狀并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)被破壞的軟骨，而關(guān)節(jié)置換這類手術(shù)級別較大，對患者的身體心理都存在的考驗[8]。截至目前，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制、原因和有效的治療方案仍不清晰。研究表明如H19、MSI2-AS1、MEG3等多種lncRNA與OA的發(fā)展都具有十分緊密的聯(lián)系[9-10]。

Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，存在MEG3/miR16/SMAD7通路，敲減大鼠軟骨細(xì)胞中的MEG3可以上調(diào)miR16促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制由外源性白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β誘導(dǎo)的炎性軟骨細(xì)胞模型中SMAD7的表達(dá)，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。同時，miR16上調(diào)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中SMAD7的表達(dá)從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子生成，達(dá)到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的目的。SMAD7是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路的細(xì)胞內(nèi)拮抗劑，在許多炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮作用，例如SMAD7的上調(diào)可以抑制慢性腎臟病中的NF-kB信號而達(dá)到抗炎的作用，這可能與其抑制骨關(guān)節(jié)炎的機制相關(guān)。相反地，MEG3上調(diào)可通過抑制miR16的表達(dá)，從而上調(diào)外源性IL-1β誘導(dǎo)的炎性軟骨細(xì)胞中SMAD7的表達(dá)，緩解骨關(guān)節(jié)炎。以上結(jié)果表明，存在MEG3-miRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，MEG3是miRNA的上游靶基因，通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游mRNA的翻譯過程，從而在OA中發(fā)揮著作用。

Li等[12]研究表明，在亞甲基藍(lán)誘導(dǎo)的OA兔子模型中，MEG3的mRNA水平顯著增加，與對照組相比，P2X嘌呤受體3(P2X Purinergic receptors 3，P2X3)的蛋白質(zhì)表達(dá)、IL-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)均受到顯著抑制。亞甲基藍(lán)可通過上調(diào)lncRNAMEG3的水平，抑制了P2X3表達(dá)從而緩解了OA相關(guān)疼痛和OA動物模型中的炎癥反應(yīng)。MEG3可以通過抑制血管生成而起到腫瘤抑制劑的作用。而骨關(guān)節(jié)炎又與血管生成密切相關(guān)，故抑制血管生成提供了一種減輕骨關(guān)節(jié)炎的炎癥與疼痛的新型辦法。

Su等[13]通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測20名OA患者和10名健康志愿者的關(guān)節(jié)軟骨樣本中MEG3和血管內(nèi)皮生長因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常軟骨樣品相比，OA患者中MEG3顯著下調(diào)，VEGF的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平卻顯著上調(diào)。表明MEG3水平與VEGF水平負(fù)相關(guān)，MEG3可通過調(diào)節(jié)血管生成參與OA發(fā)展。以上研究結(jié)果表明，MEG3可能是通過抑制P2X3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α以及VEGF等與血管生成相關(guān)的因子，從而對OA產(chǎn)生影響。

Wang等[14]實驗表明，脂多糖可降低細(xì)胞活性，增強細(xì)胞凋亡的過程，促進(jìn)促炎因子的釋放，下調(diào)MEG3的表達(dá)。作為miR-203的競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)，MEG3的敲減可通過調(diào)節(jié)miR-203正向調(diào)控Sirt1的表達(dá)過程，進(jìn)而激活PI3K/AKT和NF-kB通路，從而緩解脂多糖誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞中的炎性傷口，即存在著MEG3/miR203/Sirt1的這樣一個調(diào)控通路軸；同時Sirikaew等[15]研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖還可以破壞亞洲大象的軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致大象骨關(guān)節(jié)炎的形成。這數(shù)項研究為骨關(guān)節(jié)炎或多種炎性傷口的治療提供了一個潛在的方案。以上研究表明，MEG3可作為ceRNA，可通過吸附miRNAs，進(jìn)而與miRNAs相互競爭來調(diào)控編碼蛋白，激活PI3K/AKT和NF-kB等信號通路，從而調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展(見圖1)。

2.2 MEG3與骨肉瘤(osteosarcoma，OS)的關(guān)系 骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨腫瘤，在青少年和兒童中普遍存在。一般人群中，20歲以下的美國人骨肉瘤的發(fā)病率約為0.005‰，5年存活率約為70%，有20%～30%復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能。雖然近年來骨肉瘤的診斷和治療有所發(fā)展，分子靶向治療、手術(shù)治療等是針對骨肉瘤最重要的治療方案，但是相同治療方法下每個個體反應(yīng)有差異，這是預(yù)后改善的一大障礙[16]。

圖1 MEG3對骨關(guān)節(jié)炎OA影響通路示意圖

因此，我們需要探索骨肉瘤發(fā)展機制并確定其潛在的治療靶點以針對骨肉瘤更有效的治療。

Shen等[17]研究發(fā)現(xiàn)存在MEG3/miR-361-5p/FOXM1信號傳導(dǎo)通路。MEG3和miR-361-5p在人骨肉瘤組織和細(xì)胞系中均顯著下調(diào)，而FOXM1在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中上調(diào)。上調(diào)MEG3和miR-361-5p或下調(diào)FOXM1會抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在人骨肉瘤組織中，9種lncRNA(91H、BCAR4、FGFR3-AS1、HIF2PUT、HOTTIP、HULC、MALAT-1、TUG1、UCA1)的表達(dá)上調(diào)，并被認(rèn)為是骨肉瘤的致癌基因；兩種lncRNA(Loc285194和MEG3)的表達(dá)下調(diào)，并被認(rèn)為是骨肉瘤的腫瘤抑制劑。骨肉瘤組織中MEG3的表達(dá)明顯低于鄰近的非腫瘤組織，并且與臨床分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。相比于正常組織和細(xì)胞系，骨肉瘤中miR-664a表達(dá)水平相對較高；然而，miR-664a和lncRNA MEG3在骨肉瘤進(jìn)展中的相互作用尚未見報道。因此，Sahin等[19]將miR-664a抑制劑轉(zhuǎn)染于人成骨細(xì)胞系hFOB 1.19與人骨上皮骨肉瘤細(xì)胞系U2 OS中，發(fā)現(xiàn)MEG3基因的表達(dá)水平增加，miR-664a的表達(dá)水平降低。此外，MEG3和miR-644a表達(dá)水平的變化可干擾骨肉瘤細(xì)胞的遷移速度，miR-664a表達(dá)上調(diào)對MEG3的基因表達(dá)和骨肉瘤細(xì)胞的遷移具有抑制作用。以上研究表明，MEG3可能作為miRNA的上游靶基因，通過MEG3-miRNA-mRNA的網(wǎng)絡(luò)對miRNA的水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的基因水平，從而抑制骨肉瘤的增殖。

ceRNA的網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)被證實存在于舌鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤相關(guān)疾病中[20-21]。Jiang等[22]研究表明MEG3可作為ceRNA競爭性結(jié)合miR-424與miR-182通過這種ceRNA網(wǎng)絡(luò)在骨肉瘤疾病中發(fā)揮作用。

Tian等[23]發(fā)現(xiàn)，MEG3的上調(diào)是骨肉瘤以及其他類型癌癥(如前列腺癌)預(yù)后較好的指標(biāo)。Shi等[24]實驗發(fā)現(xiàn)，MEG3在培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞系MG63中表達(dá)較低，MEG3可促進(jìn)MG63細(xì)胞的凋亡，抑制MG63細(xì)胞的增殖與侵襲。隨著MEG3的上調(diào)，MG63細(xì)胞中的抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄活性升高，癌基因MDM2的表達(dá)降低。以上研究表明，MEG3可以通過影響原癌基因與抑癌基因的活性，進(jìn)而減緩或抑制骨肉瘤的癌變過程。

Liu等[25]研究已經(jīng)證明，MEG3可通過Notch等信號通路促進(jìn)缺血性腦損傷患者的腦血管生成。為了進(jìn)一步探討MEG3對骨肉瘤細(xì)胞的影響機制，Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與正常人成骨細(xì)胞系hFOB1.19相比，人骨肉瘤(human osteosarcoma，HOS)細(xì)胞系MG63和U2OS中MEG3的表達(dá)顯著下調(diào)。而MEG3的過表達(dá)會明顯抑制MG63細(xì)胞的增殖和遷移，抑制腫瘤相關(guān)因子TGF-β、N-cadheren、Notch1和Hes1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)E-cadheren的表達(dá)水平。結(jié)果表明MEG3可通過抑制Notch和TGF-β信號通路阻止OS細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，這為OS治療提供潛在的治療靶點。

2.3 MEG3與多發(fā)性骨腫瘤(multiple myeloma，MM)的關(guān)系 截至目前，MM是一種無法治愈的疾病，其特征是骨髓中惡性漿細(xì)胞的異常增殖和異常積聚。作為一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤，是美國第二常見血液病。盡管MM可通過蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、單克隆抗體、嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)等新型治療方法，但患者的存活率仍然非常低。主要是由于治療后耐藥率和疾病復(fù)發(fā)率高[27]。MM的骨髓瘤細(xì)胞分泌破骨細(xì)胞活性因子、激活破骨細(xì)胞從而引發(fā)病理性骨折，臨床表現(xiàn)為骨質(zhì)疼痛、貧血、骨骼變形[28]。

Shen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在人MM患者中下調(diào)，miR-181a在MM患者中過表達(dá)，與其促癌功能一致。此外，MEG3作為miR-181a的ceRNA，MEG3可在體外“海綿性”結(jié)合miR-181a，影響miR-181a對其靶基因HOXA11的調(diào)節(jié)功能，抑制MM進(jìn)展。故存在MEG3/miR-181a/HOXA11調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對MEG3進(jìn)行調(diào)控是治療MM患者的有前景的治療方案。甲基化是目前研究最多的表觀遺傳修飾，可參與細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等各種生物過程[30]。Benetatos等[31]使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)評估21名MM患者發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者M(jìn)EG3基因的甲基化區(qū)域的啟動子高甲基化。以上研究表明，MEG3可以作為ceRNA，通過吸附miRNA進(jìn)而與miRNA相互競爭，從而對靶基因做出調(diào)控，進(jìn)而抑制多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展。

3 小 結(jié)

由此可見，MEG3可以調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程，并且與骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤等骨性疾病聯(lián)系十分密切。主要包括以下四種主要的機制：(1)存在MEG3-miRNA-mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，MEG3可以作為miRNA的上游靶基因，通過調(diào)控mRNA的翻譯過程進(jìn)而對成骨分化以及骨性疾病產(chǎn)生影響。(2)存在ceRNA網(wǎng)絡(luò)，MEG3可以作為ceRNA吸附miRNA，進(jìn)而與miRNA相互競爭調(diào)控編碼基因的蛋白表達(dá)過程從而對成骨分化及骨性疾病產(chǎn)生影響。(3)MEG3可以通過激活Wnt/β-catenin、Notch、PI3K/AKT和NF-kB和TGF-β等信號通路與FOXM1的泛素化等過程對成骨分化以及骨性疾病產(chǎn)生影響。(4)MEG3能夠直接調(diào)控和成骨分化與骨性疾病相關(guān)的編碼基因，如原癌基因與抑癌基因等影響成骨分化與骨性疾病。因此，針對MEG3表達(dá)的研究可以為骨折患者及其他骨性疾病患者的治療提供潛在的靶點。MEG3能夠作用于多種miRNA或其他靶基因，從而形成一個十分復(fù)雜的骨代謝相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但是MEG3對骨性疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后影響的調(diào)節(jié)作用以及調(diào)控機制尚不清晰，這也是目前國內(nèi)外對MEG3研究的最大難題，有待于我們后期更深入的研究。相信隨著技術(shù)的突破，我們會逐漸了解MEG3如何調(diào)節(jié)骨代謝平衡及MEG3對骨相關(guān)疾病的調(diào)控機制這一研究熱點，從而為臨床上治療骨性疾病提供更加可靠的理論依據(jù)。