子癇前期中Nrf2和NQO1的關系及NQO1對HTR-8/SVneo細胞侵襲力影響的研究

吳國紅

（廣東醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院<佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院>，廣東 佛山 528300）

子嫻前期較為普遍，該病常發(fā)生在妊娠20周內，以高血壓、水腫、蛋白尿等為臨床常見表現(xiàn)，嚴重的患者可有心腎功能衰竭，此為導致孕產婦死亡主因之一[1]。近年來，隨著人們生活方式的改變，先兆子癇和子癇的發(fā)病率正在上升。子嫻前期在新生兒、孕產婦死亡率中居第二位，對孕產婦和兒童的安全與健康產生嚴重影響。子嫻前期患者的臨床特征是胎盤血管床缺乏血流灌注和小動脈痙攣，這種妊娠并發(fā)癥在圍產期較為常見，應及時并積極治療嚴重子癇前期患者，及早終止妊娠[2]。氧化和抗氧化的失衡在先兆子癇的病因和發(fā)病機理中非常重要。研究表明，先兆子癇患者血液中的超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低。本研究旨在探討子癇前期Nrf2和NQO1之間的關系以及NQO1對htr-8/svneo細胞侵襲性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究74例病例資料來源于醫(yī)院2018年1月至2020年1月收治的子癇前期患者，同時選取正常妊娠婦女74例，子癇前期組年齡23～36歲，平均（30.71±4.63）歲，孕周35～39周，平均（36.17±2.25）周，收縮壓143～162mmHg，平均（155.23±16.24）mmHg，舒張壓95～112mmHg，平均（103.52±8.54）mmHg，孕次1～3次，平均（2.0±0.5）次，產次0～1次，平均（0.6±0.1）次；對照組年齡22～37歲，平均（30.50±4.55）歲，孕周35～40周，平均（38.03±2.10）周，收縮壓110～124mmHg，平均（116.54±5.21）mmHg，舒張壓65～75mmHg，平均（68.75±3.63）mmHg，孕次1～3次，平均（2.0±0.5）次，產次0～1次，平均（0.6±0.1）次。

1.2 研究方法：所有研究對象均抽取空腹靜脈血，離心后取血漿，開展Nrf2和NQO1水平檢測，Nrf2水平的檢測方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，血漿內的Nrf2和酶標本上包被的Nrf2抗體發(fā)生結合，生成結合物，其能夠和后續(xù)加入的Nrf2抗體、HRP標記的親和素發(fā)生有效反應，從而取得免疫復合物，在波長450nm處對OD值進行測量，開展Nrf2濃度計算。NQO1水平測量方法同樣為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測原理與Nrf2相同。

NQO1對HTR-8/SVneo細胞侵襲力的檢測方法為：采用移液器對Eagle培養(yǎng)基、雙抗（1mL）以及胎牛血清（10mL）進行吸取，將其放入到滅菌瓶內，然后采用移液器對Eagle培養(yǎng)基吸取，吸取量為7mL，加入2mL胎牛血清和1mL二甲基亞砜，混合均勻。采用移液器對雙氧水吸取，吸取量為9.64μL，采用Eagle培養(yǎng)基加入，使其被稀釋為250μmol/L，然后以濾膜過濾。首先將細胞進行復蘇，然后開展細胞傳代，最后開展細胞凍存。測量氧化應激模型中ROS的方法為：將HTR-8/SVneo細胞進行分組，對照組采用Eagle培養(yǎng)基加入，實驗組采用雙氧水處理液加入，培養(yǎng)4h，向瓶內加入3mL胰酶，消化后在顯微鏡下觀察，在1000r/min速度下離心5min，去除上清液，應用PBS對細胞進行沖洗，繼續(xù)離心5min，將上層血清去除，加入DCFH-DA溶液3mL，孵育30min，將離心管取出，繼續(xù)離心5min，將上層清液去除，應用PBS對細胞進行沖洗，再次離心，采用PBS對細胞沉淀進行重懸，應用流失細胞儀后實施檢測。隨后開展氧化應激模型中細胞存活率測定，采用對數期HTR-8/SVneo細胞，移液器分組，吸取100μLPBS加入空白組每孔中，顯微鏡下棄去每孔中細胞懸液，實驗組加雙氧水處理液，對照組加Eagle培養(yǎng)基，孵育12 h后，將雙氧水處理液去除，低速震蕩10min上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理：運用SPSS 20.0軟件分析數據，計量資料（±s）采用t檢驗，計數資料（n，%）采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組Nrf2和NQO1表達水平比較：子癇前期患者的Nrf2和NQO1水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），子癇前期患者的Nrf2和NQO1表達水平表現(xiàn)為正相關（r=0.916，P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組Nrf2和NQO1表達水平比較（±s）

表1 兩組Nrf2和NQO1表達水平比較（±s）

組別 n對照組 74觀察組 74 tP Nrf2（ng/mL）3.68±0.542.18±0.3919.3710.001 NQO1（ng/mL）2.61±0.411.16±0.2226.8070.001

2.2 NQO1對HTR-8/SVneo細胞侵襲力影響：細胞中Nrf2、NQO1蛋白以及NQO1mRNA雙氧水組和tBHQ組相較于對照組，具備更高的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ML385組與對照組的細胞中Nrf2、NQO1蛋白以及NQO1mRNA相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；相較于雙氧水組，雙氧水聯(lián)合ML385組的細胞中Nrf2、NQO1蛋白和NQO1mRNA相對表達水平均更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 NQO1對HTR-8/SVneo細胞侵襲力影響（±s）

表2 NQO1對HTR-8/SVneo細胞侵襲力影響（±s）

指標 對照組 雙氧水組 tBHQ組 ML385組 雙氧水聯(lián)合ML385組Nrf2（ng/mL） 0.23±0.051.22±0.211.26±0.360.26±0.040.35±0.15 NQO1（ng/mL） 0.28±0.080.63±0.150.72±0.210.23±0.060.28±0.03

3 討論

重度子癇前期病因復雜，臨床上認為與其相關的因素就有免疫調節(jié)功能異常、血管內皮損傷、滋養(yǎng)細胞侵襲異常、遺傳等，但具體發(fā)病機制尚未有明確的定性。全身小動脈痙攣、內皮功能障礙是重度子癇前期患者發(fā)病后主要病理改變[8]。該病會對胎兒發(fā)育產生不良影響，不利于妊娠結局，目前，對其的臨床診斷指標有限，因此積極探索有效診斷指標來評估重度子癇前期的程度可為該病的有效防治提供依據[9]。

Nrf2作為氧化還原轉錄因子，已在國內外進行了廣泛研究，它通過與抗氧化元素反應相互作用來激活下游抗氧化酶和解毒酶基因的表達，從而保護人體免受內源性和外源性的壓力因素的影響[11]。已知血紅素加氧酶1（HO-1）受Nrf2調節(jié)，是最重要的抗氧化劑保護蛋白，它是人體的典型保護和防御系統(tǒng)，覆蓋大腦、心臟、肝臟和其他器官。Nrf2在一般正常情況下與胞漿蛋白伴侶分子結合而處于一種抑制狀態(tài)。當受到各種刺激時，Nrf2可與胞漿蛋白伴侶分子解離并從胞漿轉移至細胞核再與ARE結合，調控下游血紅素加氧酶1、NQO l，谷胱甘肽-S-轉移酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶、細胞色素P450s和多藥耐藥蛋白等抗氧化酶的表達，從而使機體對外界刺激的抵抗力增強[12]。Nrf通路可產生抗氧化、抗炎、減輕Ca2+超載等作用。有研究顯示Nrf2基因敲除的小鼠抗氧化能力下降，哮喘炎癥加重，提示Nrf2在哮喘中具有重要的作用[13]。

有研究表明Nrf2和NQO1直接影響肝臟和胃腸道疾病的進展[14]，但其是否參與子癇前期的病變過程暫無相關研究佐證。血漿中Nrf2、NQO1水平，子癇前期患者較正常妊娠婦女低，且兩者間呈正相關。為進一步證明Nrf2與NQO1之間的相關性，使用了htr-8/svneo細胞，結果顯示在htr-8/svneo細胞中NQO1水平變化和Nrf2水平變化呈正相關，說明Nrf2水平下降可對Nrf2途徑的激活起抑制作用，進而降低Nrf2途徑下游的NQO1表達。目前，先兆子癇暫無有效的治療方法及預防措施，為避免不良結局只能及時終止妊娠。PE患者胎盤的病理特征是htr-8/svneo細胞浸潤低，子宮螺旋動脈浸潤不足，導致血管狹窄[15]。因此，尋找增強htr-8/svneo細胞侵襲性的因素在子癇前期患者的治療中極為迫切及重要。氧化應激作用下致使htr-8/svneo細胞迅速調亡大量減少，受其影響繼而細胞浸潤方向的分化發(fā)生改變，同時還影響子宮螺旋動脈的重建，致使胎盤缺氧的惡性循環(huán)加劇，進而造成不良妊娠結局[16]。有研究稱，氧化應激可致使先兆子癇患者htr-8/svneo細胞的侵襲性降低，但具體機制不明[17]。這些結果表明在htr-8/svneo細胞中，NQO1水平隨著Nrf2水平變化而變化，氧化應激過程中NQO1水平的改變可增強（或減弱）htr-8/svneo細胞的侵襲性。

綜上所述，子癇前期患者的Nrf2、NQO1下降，其會導致機體抗氧化能力減弱，在氧化應激條件下，Nrf2可激活NQO1從而使HTR-8/SVneo細胞侵襲力增強。