正交試驗優選地稔多糖提取工藝*

張 帆，毛卓炯，劉亞平，金 鐳△，葉喜德

（1. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院藥劑科，安徽 合肥 230031； 2. 江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004）

地稔Melastoma dodecandrumLour. 為野牡丹科植物地稔干燥全草，又名山地、鋪地稔、落地稔、地茄等[1]，主要分布于廣西、湖南、廣東、江蘇、浙江、福建等地，適宜于山坡路旁矮草叢的酸性土壤中生長。地稔性涼，味甘、澀，有活血止血、消腫祛瘀、清熱解毒功效[2]，臨床常用于治療熱入營血所致高熱、瘡瘍腫毒、咽喉腫痛、風火牙痛、痛經等證，也可治療痔瘡、毒蛇咬傷等[3]。多糖為地稔主要成分之一，有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、降血糖、調血脂等作用[4]。目前對地稔成分的研究多集中于黃酮類[5]和凝集素類成分[6]，對沒食子酸[7]、多糖[8]和揮發油[9]等主要分析其含量和性質，而地稔多糖提取相關內容尚未見報道。多糖為水溶性成分，通常以水為溶劑[10-11]，采用回流提取法提取，但也有微波提取的報道[12]。本研究中以多糖含量為評價指標，通過單因素考察，比較微波提取與回流提取的多糖提取率。在此基礎上，采用正交試驗優化提取工藝，為深入開發地稔藥用資源提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-8000S 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；BT25S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度為0.01 mg）；TDL-80-2C 型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KDM 型控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器有限公司）；HWC-3LA 型微波提取儀（廣州興興微波能設備有限公司）；離心機（德國Thermo公司）；OSB-2200 型旋轉蒸發儀（廈門精藝興業科技有限公司）；HH-66 型多功能數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

地稔飲片（江西天施康中藥股份有限公司，批號為20191127）；D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為190852-201904）；苯酚、濃硫酸、95%乙醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 多糖含量測定

對照品溶液制備：取干燥后的D-無水葡萄糖60 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，保存，備用。

供試品溶液制備：取地稔飲片20 g，浸泡30 min，回流提取后，濾過，濃縮至20 mL，加4 倍量95%乙醇，醇沉過夜，離心，取沉淀稀釋至1000 mL，再取10 mL 稀釋至100 mL，備用。

測定波長選擇：取對照品溶液，進行全波長掃描，結果在490nm 波長處吸光度最高，干擾最小，故以此為檢測波長。

線性關系考察：精密量取對照品溶液1，2，3，4，5 mL，分別置50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；分別取2 mL，置具塞試管中，加5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加濃硫酸7.5 mL，輕搖，室溫放置15 min，冷卻30 min，取出，以相應試劑為空白對照，進樣，測定吸光度[18]。以吸光度（Y）為縱坐標、待測溶液質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.0472X+0.0573，R2=0.9986（n=5），待測溶液質量濃度線性范圍為0.0582 ～0.2912 mg/mL。

樣品含量測定：精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL具塞試管中，按線性關系考察項下方法操作，代入回歸方程，計算含量。

2.2 單因素考察

2.2.1 微波提取法

提取時間：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，按料液比1 ∶30（g/mL，下同）加水600 mL，置微波提取設備中，于700 W 功率下分別提取5，10，15，20，25 min，同法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖1）。多糖提取率在5 ～20 min 內處于平穩狀態，此后呈下降趨勢。可能是由于長時間微波輻射的作用，雜質溶出較多或地稔多糖穩定性下降，從而影響其含量。綜合考慮時間和能源消耗，微波提取時間不宜過長。

圖1 微波提取時間對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave extraction time on the extraction yield of polysaccharide

料液比：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，固定提取時間15 min、微波功率700 W，分別以料液比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50 的比例加水提取，平行試驗3 次，同法測定多糖含量（見圖2）。多糖含量在料液比達1 ∶40 時呈下降趨勢，為1 ∶20 時的地稔多糖提取率相對較高。

圖2 加水量（液料比）對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of water addition（liquid-material ratio）on the extraction yield of polysaccharide

微波功率：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，按上述提取條件，固定料液比和提取時間，其中料液比按1 ∶20 加水400 mL、提取時間為15 min，分別于400，500，600，700，800 W 提取功率下提取，按前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖3）。地稔多糖提取率隨著微波功率的增大而升高。

圖3 微波功率對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction yield of polysaccharide

提取次數：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，固定料液比為1 ∶20，提取功率為700 W，提取時間為15 min，分別提取1，2，3 次，按前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖4）。可見，微波提取次數對多糖提取率的影響相差較小。

圖4 提取次數對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction yield of polysaccharide

2.2.2 回流提取法

提取時間：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，按料液比1 ∶20 加水400 mL，分別提取1，2，3，4，5 h，依照前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖5）。1 ～2 h 多糖提取率顯著增加，此后隨著時間的延長未見顯著變化，綜合能耗和時間考慮，故以2 h 為最佳提取時間。

圖5 回流提取時間對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of reflux extraction time on the extraction yield of polysaccharide

料液比：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，固定提取時間為2 h，分別按料液比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50 的比例加水提取，依照前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖2）。可見，料液比對地稔多糖提取率的影響并不大，考慮地稔飲片具有吸水性，為了使藥材完全浸泡，綜合考慮，故以料液比1 ∶20 為佳。

提取次數：稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，固定料液比1 ∶20 加水400 mL、提取時間為2 h，分別提取1，2，3 次，依照前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖4）。可見，提取次數越多，地稔多糖的提取率也相應升高，其中回流提取率增高趨勢比微波提取率顯著。

2.2.3 微波輔助回流提取

稱取地稔飲片干燥后的粉末20 g，按料液比1 ∶20加水400 mL，先于700 W 功率下微波提取15 min，再回流提取2 h，依照前述方法測定多糖含量，平行試驗3 次（見圖6）。可見，微波輔助回流提取率并不明顯高于直接回流提取。

圖6 微波輔助回流提取與回流提取的效果比較Fig.6 Comparison of microwave assisted reflux extraction and reflux extraction

2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，地稔多糖回流提取效果優于微波提取，故選擇回流提取工藝進行優化。以提取時間（A）、料液比（B）、提取次數（C）為影響因素，采用L9（34）正交試驗表進行設計和試驗，平行操作3次，按前述方法測定多糖含量，計算綜合評分，以多糖含量為評價指標，優化提取工藝參數。因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

結果見表2 和表3。各因素對提取效果影響程度為C ＞A ＞B，因素A、因素C 是顯著因素。結合試驗結果和實際應用，優選最佳提取工藝為A2B1C3，即加20 倍水，提取3 次，每次2 h。

表2 正交試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 方差分析結果Tab.3 Results of variance analysis

2.5 驗證試驗

分別稱取同一批地稔飲片20 g，平行制備3 份，用20 倍水浸泡30 min，提取3 次，每次2 h。在該工藝下，地稔多糖的提取率為1.1%。

3 討論

多糖是由多個單糖縮合而成的一種生物大分子物質，常以糖苷鍵線性或分枝鏈接而成。許多中藥如枸杞、黃芪和靈芝等均以其為有效活性成分[13]。目前，多糖含量測定方法一般有比色法、高效液相色譜法和滴定法等。其中使用較廣的是比色法，主要包括苯酚硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法和硫酸蒽酮法等[14-15]。多糖含量測定易受藥材質地、反應時間和溫度、對照品等多種因素的影響。鑒于地稔多糖提取未見文獻報道，本試驗中按預試驗結果，以D-無水葡萄糖為對照品，選擇苯酚硫酸法測定多糖含量，選擇影響多糖提取率的因素進行了方法學考察。單因素考察選擇的主要依據是由地稔多糖的理化性質及預試驗結果決定的。由于同一因素在不同條件下會影響到地鯰多糖的提取率；同時，幾個不同因素在各自不同條件下會對多糖提取得率產生交互作用。因此，在單因素試驗中，只能逐步對每個因素進行考察，而將其他因素設為固定。設計這種方法的先決條件，是假設各因素間不會產生交互作用。故在本試驗中選擇了提取時間、料液比、提取次數3 個影響多糖提取率的因素進行考察，目的是探討這些因素在不同條件下對多糖提取率的影響。根據多糖測定原理，在硫酸作用下多糖易分解成單糖后，迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合生成穩定的橙黃色化合物，于490 nm 波長處和一定質量濃度范圍內，其吸光度與多糖含量呈線性關系。結果表明，葡萄糖溶液在其線性范圍內與吸光度線性關系良好，可利用標準曲線定量測定樣品中多糖的含量。

多糖提取方法較多，主要有水提醇沉法[16]、超聲提取法[17]、微波提取法[18]、酶解輔助提取法[19]和回流提取法[20]等。其中，超聲提取是利用超聲空化效應、熱反應和機械作用，借助超聲波對介質的作用，使被提取成分加速溶出的有一種方法。但多糖經超聲處理后，糖苷鍵易發生斷裂，降低得率。酶解輔助提取法雖可提高多糖得率，但由于提取條件嚴格，增加了成本，不利于工業化生產。微波提取是通過極性溶劑和細胞液對微波能的吸收，使細胞內部及其周邊環境溫度迅速升高，超過細胞壁承受范圍時，使化合物易于溶出的一種提取方法。而回流提取是常用方法，通過循環回流溶劑對藥材的浸出，使多糖充分溶出。相比其他提取工藝，該方法操作簡單，成本低，提取效率高，利于工業化生產。基于此，本試驗中比較了微波和回流2 種提取方法，以多糖提取率為評價指標進行了工藝考察。對于微波提取，首先通過單因素試驗，確定提取時間、料液比、微波功率、提取次數等因素對多糖含量的影響。結果表明，微波提取時間過長會影響提取得率，料液比為1 ∶20，并隨微波功率和次數增加而使多糖含量增高。對于回流提取，確定最佳回流提取時間為2 h，而料液比及采用微波輔助回流提取，對多糖提取率影響較小，但提取次數增多可提高多糖提取率。

為進一步考察微波提取工藝，在正交試驗中，參數選擇的主要依據是對地鯰多糖的提取率影響較大，并進一步確認這些因素的影響強弱順序，從而確定最佳提取工藝條件，提高多糖提取率。綜合分析研究結果，微波提取比回流提取時間短，但地稔多糖提取率較回流提取低。說明微波在提取過程中，可能由于微波輻射產生的高熱能，破壞了地稔多糖的分子結構，影響了提取率。回流提取中，多糖類易溶于水，在提取過程中不易破壞糖分子結構，使得提取率較高。但這些原因仍有待深入研究。

綜上所述，回流提取相對微波提取，多糖提取率更高，更適合地稔多糖的提取，其工藝優選條件為液料比20 ∶1（即加20 倍水），提取3 次，每次2 h。驗證試驗結果顯示，該提取工藝穩定、可行，可為地稔多糖工藝研究奠定基礎。鑒于目前未見地稔多糖提取的文獻報道，尚難把本研究成果與其他研究進行比較。