復方氣管炎片微生物限度檢查方法適用性研究

閔 朕，衛延明，杜思迪

（陜西省渭南市食品藥品檢驗所，陜西 渭南 714000）

中藥飲片的微生物污染嚴重[1- 2]，微生物限度檢查是保障其安全性的重要措施。微生物方法適用性的本質就是建立對樣品影響更小、操作得率更高的方法[3]。去除藥品的抑菌性是微生物限度檢查方法適用性試驗的重點和難點，也是避免出現假陰性結果的重要環節[4]。中藥種類多，相互關系復雜[5]，清熱藥、瀉下藥等均具有抑菌性[6]，加之中西醫抑菌藥物聯用具有抗菌增敏作用[7-8]，其抑菌作用較強，故建立具有抑菌性的中藥制劑的微生物限度檢查方法較困難。復方氣管炎片臨床多用于治療急慢性支氣管炎、咳嗽等癥，具有中藥和西藥的多種抑菌成分，抑菌性強且不易去除，建立微生物限度檢查方法難度較大。本研究中采取平皿法、稀釋法、薄膜過濾法及多法聯用的方式進行漸進式研究，建立了復方氣管炎片的微生物限度檢查方法。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與菌種

儀器：BS2202S 型電子天平（德國Sartorius 公司），PB-10 型pH 酸度計（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司）；VITEK2 Compact 型全自動微生物生化鑒定系統（法國BioMérieux 公司）；HFsafe-1200LC 型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；LRH-250 型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；WJ-6 型無菌檢查儀（天津市羅根科技有限公司）；OLYMPUS-CH 型顯微鏡（日本Olympus 公司）；渦旋混合器（德國IKA 公司）；FC752 型薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司）。

樣品及培養基：復方氣管炎片（陜西春暉藥業有限公司，批號為190706，規格為每片0.35 g）；胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基、胰酪大豆胨液體（TSB）培養基、沙氏葡萄糖液體（SDB）培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基，均購自北京陸橋技術有限責任公司，適用性檢查結果符合2015年版《中國藥典（四部）》通則要求；pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液按2015年版《中國藥典》要求配制和滅菌。

菌 種：大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均來自中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為新鮮制備的第3 代菌懸液。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備

取樣品10 g，精密稱定，加入100 mL TSB 培養基中，45 ℃水浴恒溫振搖15 min，混勻，靜置15 min，制成1 ∶10 供試液；取50，20 mL，分別加入含50，80 mL TSB培養基無菌瓶中，混勻，制得1 ∶20，1 ∶50 供試液。

1.2.2 計數方法適用性試驗

平皿法：試驗組，取上述3 種供試液，分別裝滿5 個9.9 mL 無菌試管，再分別加入新鮮制備的含菌量不大于104cfu/mL 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各0.1 mL。對照組，取制備好的1 ∶10 供試液9.9 mL，加入0.1 mL TSB 培養基。菌液組，取TSB 培養基分裝于5 個9.9 mL 無菌試管，其后操作同試驗組。分別取1 mL 供試液，置直徑為90 mm 或150 mm 的無菌平皿中，加入不超過45 ℃的TSA 培養基或SDA 培養基約20 mL 或50 mL。待各平皿中的液體凝固后，分別按規定培養條件培養并計數。

薄膜過濾法：試驗組，取1 ∶20 供試液1 mL，加入含100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液的輸液瓶，薄膜過濾，用pH7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗3 次，每次100mL。在最后一次沖洗液中分別加入含菌量不大于100 cfu/mL的上述菌液1 mL。對照組，取制備好的1 ∶20 供試液1 mL，不加試驗菌，其余操作同試驗組。菌液組，除不加供試液外，其余操作同試驗組。制備好的濾膜，菌面朝上貼于TSA 培養基上，按規定條件倒置培養，計數。

以上2 種方法中，各試驗菌的回收率為試驗組平均菌落數與對照組平均菌落數之差除以菌液組平均菌落數的值。若均為0.5 ～2.0，則判定方法通過。

1.2.3 控制菌檢查方法適用性試驗

試驗組，分別取1 ∶10 供試液10 mL，分別接種至100，200，500 mL TSB 培養基中，同時分別加入含菌量不大于100 cfu/mL 的大腸埃希菌1 mL，混勻，35 ℃條件下培養18 h，取上述培養物1 mL，接種至100 mL 麥康凱液體培養基中，42 ℃條件下培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基上，35 ℃條件下培養18 h，以全自動微生物生化鑒定系統鑒定、確認。陰性對照組，除不加試驗菌外，其余操作同試驗組。陽性對照組，除不加供試液外，其余操作同試驗組。平行檢測3 次。

若檢出并確認為大腸埃希菌，則可采用供試液制備方法及檢查法進行供試品的大腸埃希菌檢查。

2 結果

2.1 計數方法適用性

結果見表1。需氧菌總數（TAMC）計數方法的適用性研究結果表明，平皿法（1 ∶10 供試液）和稀釋法（1 ∶20，1 ∶50 供試液）均不能有效去除供試液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用，回收試驗失敗；采用1 ∶10 供試液薄膜過濾會導致濾膜堵塞，無法過濾；采用1 ∶20 供試液平皿法與薄膜過濾法聯用的方式可過濾，且各試驗菌回收率均在0.5 ～2.0 之間，符合2015年版《中國藥典》的要求。

表1 樣品微生物計數法回收試驗（n=3）Tab.1 Recovery test of the method for counting the microorganisms in a sample（n=3）

霉菌和酵母菌總數（TYMC）的計數方法適用性研究結果表明，可采用1 ∶10 供試液平皿法進行霉菌和酵母菌總數的檢查，各試驗菌回收率均在0.5 ～2.0 之間，符合2015年版《中國藥典》的要求。

2.2 控制菌檢查方法適用性

結果見表2。采用1 ∶10 供試液10 mL 分別接種至100，200 mL TSB 培養基中，試驗菌均無法恢復生長，說明其無法有效去除供試液的抑菌性。采取1 ∶10 供試液10 mL 接種至500 mL TSB 培養基中進行方法適用性研究，大腸埃希菌在麥康凱瓊脂培養基上的表型為表面光滑、濕潤，桃紅色圓形菌落，顯微鏡下觀察結果為革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓，無芽孢。經系統確認為大腸埃希菌，表明該方法可用于樣品的控制菌檢查。

表2 樣品控制菌檢查方法適用性試驗結果（n=3）Tab.2 The results of applicability test of the detection method of controlled bacteria test（n=3）

3 討論

復方氣管炎片的處方由瓜蔞、葶藶子、陳皮、茯苓、甘草、甲氧芐啶、鹽酸異丙嗪、磺胺甲唑等組成，其中磺胺甲唑和甲氧芐啶復方為中效磺胺類藥，且為廣譜抑菌劑，對革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌）、革蘭陰性菌（如大腸埃希菌）均有較強的抗菌活性。瓜蔞中的瓜蔞子揮發油、瓜蔞皮總皂苷等對金黃色葡萄球菌有抑制作用[9]，陳皮中的雙氫川陳皮素、川陳皮素具有抗炎、抗菌、抗氧化等藥理作用[10]。甘草中的黃酮類化合物也有一定抑菌性[11]。因此，復方氣管炎片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌等試驗菌表現出較強的抑菌性。

具有抑菌作用的中藥與西藥復方制劑協同產生的較強且難以去除的抑菌性是建立復方氣管炎片微生物限度檢查法的主要障礙。本試驗在進行TAMC 方法適用性研究時采用了平皿（直徑150 mm）法聯合稀釋法，但無法完全去除抑菌性。采用中和法聯合稀釋法（即1 ∶50供試液100 mL 中加入對氨基苯甲酸溶液1 mL）仍無法去除對金黃色葡萄球菌的抑菌性，因此改用薄膜過濾法。對中藥制劑進行方法適用性研究時，供試品中常存在較多藥渣，采用薄膜過濾法易產生濾膜堵塞的問題[12-14]，限制了該方法的應用。因此，改用稀釋法聯合薄膜過濾法對TAMC 進行方法適用性試驗。

中藥制劑的理化性質和生物活性的特殊性，使在建立微生物限度檢查法時常需聯用藥典要求的常用檢測方法[15]，如采用稀釋法和薄膜過濾法以消除其抑菌性[16]。稀釋法能有效清除抑菌成分，達到檢驗目的[17]，稀釋法和薄膜過濾法本質上都是降低或去除抑菌成分的抑菌性對檢查結果的干擾，避免假陰性結果的產生[18]。本研究中聯用2 種方法，有進一步去除抑菌性和易于過濾的優點，為建立具有較強抑菌性的中西藥復方制劑的微生物限度檢查方法提供了新思路。