高效液相色譜法測定萬應跌打酒中士的寧含量

陳繼英，蓬展鵬，吳 謀，莫楚銘

（廣東省東莞市中醫院，廣東 東莞 523000）

萬應跌打酒由醋乳香、醋沒藥、當歸尾、制馬錢子、骨碎補、梔子等22 味中藥經現代工藝提取制成，用于治療跌打損傷、氣滯血瘀痹癥，療效確切。該酒劑2017年再注冊批件中的審評意見為“申報單位應繼續對士的寧的限度檢查方法進行研究，并列入標準”。但目前士的寧含量測定中的對照品為士的寧[1]，中國食品藥品檢定研究院網站中國家藥品標準物質特殊標準物質顯示，烏頭堿、士的寧、馬錢子堿均屬劇毒類危險化學品，應暫時停止供應。為保證用藥安全，本研究中以馬錢子總生物堿對照品為對照，參照《中國藥典》標準，采用高效液相色譜（HPLC）法對萬應跌打酒處方中有毒藥味制馬錢子進行士的寧的限量檢測，并擬訂樣品中士的寧毒性限度的檢查范圍。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（美國安捷倫科技公司）；AUW120D 型電子分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；PL-S30T 型超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

1.2 試藥

萬應跌打酒（東莞市中醫院制劑室，批號分別為20190102，20190408，20190601）；馬錢子總生物堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為112030-201601，含馬錢子堿45.40%、士的寧49.90%）；乙腈、磷酸二氫鉀、庚烷磺酸鈉、磷酸（色譜純，德國Merck公司）；三氯甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參照2015年版《中國藥典（一部）》“馬錢子含量測定”項，馬錢子堿、士的寧的檢測波長為260 nm[1]；馬錢子堿、士的寧的流動相為乙腈-0.01 moL/L 庚烷磺酸鈉與0.02 moL/L 磷酸二氫鉀等量混合溶液（用10%磷酸調pH 至2.8）（21 ∶79，V/ V）[2-5]；理論板數按士的寧峰計應不低于5000；預試驗中色譜柱Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離度尚可，但理論板數不足5000，后更換為AgilentTC-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），符合要求；流速為1.0 mL/min；柱溫為250 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取馬錢子總生物堿對照品3.0 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加三氯甲烷溶解，并用甲醇定容，搖勻，即得每1 mL 含馬錢子堿0.1362 mg、士的寧0.1497 mg 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品10 mL，置具塞錐形瓶中，加入0.5%鹽酸溶液10 mL，混勻，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，移至分液漏斗中，錐形瓶用0.5%鹽酸溶液10 mL 反復洗滌，合并洗液，加濃氨試液調pH至9 ～10，用三氯甲烷振搖提取3 次，每次20 mL；合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇10 mL 溶解，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：取不含制馬錢子的樣品10 mL，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察[6-9]

專屬性考察：按2.1 項下色譜條件，取陰性對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液各適量，進樣測定，色譜圖見圖1。結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖1.brucine 2.strychnine A.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取馬錢子總生物堿對照品3.0 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加三氯甲烷適量溶解，并用甲醇定容，搖勻，即得每1 mL 含馬錢子堿0.1013 mg、士的寧0.1140 mg 的溶液，依次稀釋，得馬錢子堿質量濃度為81.04，60.78，50.67，25.33，12.66 μg / mL和 士 的 寧 質 量 濃 度 為91.21，68.41，55.70，27.85，13.92 μg / mL 的系列混合對照品溶液，精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y）、士的寧質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=19.394X+2.9418（r=0.9997，n =5）。結果表明，士的寧質量濃度在13.92 ～114.02 μg / mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果的RSD為0.17% （n =6），表明儀器 精 密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為20190102）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算士的寧含量。結果的RSD為1.58%（n =6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液（批號為20190102）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，22，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.20（n=8），表明室溫下供試品溶液在24 h 內基本穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20190102，士的寧含量為32.55 μg / mL）6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入馬錢子總生物堿對照品溶液（每1 mL含馬錢子堿0.2027 mg / mL、士的寧0.2228 mg/mL）1 mL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

耐用性試驗[10]：取樣品（批號為20190102）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.1 項下色譜條件分別設置色譜柱，包括卡賽帕克MGII 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；迪馬Diamonsil 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters RP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。結果的RSD為0.90%，顯示色譜柱發生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

表1 士的寧加樣回收試驗測定結果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests of strychnine（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品（批號分別為20190102，20190408，20190601）各適量，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，并平行測定3 次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3 批樣品中士的寧含量分別為31.8，32.1，33.0 μg/mL，平 均32.3 μg/mL，RSD分 別 為1.30%，1.50%，2.20%。

2.5 樣品中士的寧毒性限度檢查范圍確定

依據2015年版《中國藥典（一部）》馬錢子粉項下規定，士的寧含量限度不得過0.82%，其“用法用量”項下規定，馬錢子的服用量為0.6 g，折算后士的寧每天服用量約為4.92 mg，為每天最大安全服用量[11-12]。用馬錢子粉中士的寧的每天最大安全服用量除以萬應跌打酒的平均含量，得出萬應跌打酒每天最大使用量不能超過152 mL。

根據樣品的用法用量，每天使用3 次，每次常用量為10 mL，每天的常規使用量為30 mL。按馬錢子粉的理論安全服用量的最大值計算，萬應跌打酒每1 mL 含士的寧應不得超過164 μg。為保證臨床用藥安全，減少不良反應，按2015年版《中國藥典（一部）》馬錢子粉項下士的寧含量限度計算，并結合實際的試驗結果，初步擬訂萬應跌打酒士的寧最高限度范圍為每1 mL 含士的寧不得超過100 μg。

3 討論

中醫把凡因外力作用于人體而引起的筋骨傷損、瘀血腫痛、氣血不和、經絡不通以至臟器受損等統稱為跌打損傷[13]。萬應跌打酒用于治療跌打損傷（現代醫學又稱急性軟組織損傷）。處方中的制馬錢子味辛、性溫，可散寒溫通經絡，消腫散結止痛；主要有效成分為生物堿，生物堿中含量較高的為士的寧和馬錢子堿，既是有效成分又是有毒成分，故需對含制馬錢子制劑的毒性成分進行限度檢查，以確保臨床用藥的安全性。制馬錢子的毒性反應主要由超安全劑量口服引起，口服馬錢子堿中毒劑量為15 ～100 mg（平均50 mg）。馬錢子中毒劑量與治療劑量非常接近，須合理應用，以避免中毒反應及確保療效[14]，尤其是應規范此類含有大毒藥味的中藥制劑的臨床用藥[15]。