誘導多能干細胞治療青光眼的研究進展

談思益 綜述，康偉超 審校

(徐州醫科大學：1.第二臨床醫學院；2.麻醉學院，江蘇 徐州 221004)

人眼是人體結構中最復雜的結構之一，由數百萬個具有不同細胞類型的組織構成。眼睛在解剖學上可分為前部和后部。前部包含角膜、虹膜、瞳孔和晶狀體，后部則由鞏膜、脈絡膜、視網膜、黃斑和視神經組成。光線通過角膜和晶狀體進入眼內，位于眼后的視網膜將聚焦的光的輸入轉變為電信號的模式，然后傳輸到大腦形成周圍環境的視覺圖像，但視覺處理的第一步發生在視網膜。

1 視網膜發育的過程

視網膜起源于神經系統發育形成的神經外胚層，因此，視網膜也被認為是大腦的一部分[1]。超過30%的大腦功能是分析眼睛攜帶的光的信息[2]。視網膜神經節細胞(RGC)是視網膜中最先出現的細胞類型之一，緊隨其后的是無長突細胞、視錐細胞和水平細胞。在視網膜發育的后期，產生桿狀細胞，接著是雙極細胞，最后是Müller膠質細胞。RGC位于視網膜結構中的最內層，光感受器則更多地占據外圍層。一些細胞外信號分子調節眼的發育過程，包括Wnt[3]、胰島素樣生長因子(IGFs)[4]、成纖維細胞生長因子(FGFs)[5]、Notch、骨形態發生蛋白(BMPs)、維甲酸(RA)[6]。這些細胞外信號分子在發育的不同階段出現，以調節一系列不同的發育事件。RGC是連接到大腦軸突的小神經元，將光信號發送到大腦指定區域，如外側膝狀核或視上丘，作為視網膜的最終輸出[7-8]。因此，RGC有更大的細胞體和更粗的軸突，這都是動作電位遠距離傳播所必需的[9-10]。這些軸突在神經纖維層中聚集在一起形成視神經。RGC在將視覺信息從眼睛傳遞到大腦中起著至關重要的作用。當RGC的傳導因疾病或損傷被切斷，從而抑制光信息到達適當的處理中心，進而導致視力喪失和失明。

2 青光眼疾病的特點

青光眼是一組以RGC進行性退化為特征的視網膜疾病，是不可逆轉失明的主要原因之一。據估計，全球有超過7 600萬人受青光眼影響，2040年影響約1.118億人[11]。我國40歲以上人群青光眼患病率為1.5%～3.6%[12]。盡管青光眼在全球普遍流行，但目前還沒有有效的治療方法來治療RGC的退化和隨后的視野損傷。目前針對青光眼的治療大多數都旨在降低眼壓來限制視力喪失的進展，因為高眼壓是青光眼唯一確認的可改變的危險因素[13]。然而青光眼也可以在正常眼壓下發生[14]，所以降低眼壓不能有效防止視力喪失。因此針對RGC退變及視力損傷機制的研究，以及RGC的移植替代研究具有重要的意義。

各種用于治療青光眼的細胞療法正在研究當中。青光眼明顯的表現是RGC的丟失。傳統對抗RGC變性的方法是依賴于在疾病過程的早期階段進行治療，此時神經保護仍然有效。實際上大多數視神經病變患者在診斷時已經產生了顯著的RGC丟失，并且在疾病的后期階段，大量不可逆轉的細胞丟失使得神經保護變得徒勞。在這種情況下，移植健康的RGC以取代退化的細胞是恢復視覺功能的最后選擇。然而，由于RGC軸突的遠距離投射及有效地恢復突觸的功能性等障礙，RGC的替代策略一直缺乏成功的發展。目前干細胞療法已經在帕金森病和脊髓損傷等神經退行性疾病中被證明具有改善作用，治療的成功在于對損傷、丟失的神經元進行替換。實際上，由于人眼是脊椎動物體內的免疫優勢部位，因此一直處于干細胞移植研究的前沿[15]。移植細胞的免疫排斥問題是決定移植后細胞能否在宿主體內存活并良好整合的關鍵。而由于血-眼屏障、眼內腔的免疫抑制微環境和前房相關的免疫偏離存在使眼具有了獨特的免疫赦免條件。此外，移植細胞的作用機制不僅在于完成細胞整合和補充的任務，還在于提供神經保護環境，產生生長因子和細胞因子，減緩神經退變過程，恢復視功能。

3 神經節細胞的標志物

RGC功能特性可作為鑒別和純化篩選細胞的依據之一。RGC具有對谷氨酸做出反應的能力[16-17]，還表現出興奮性突觸后電位(EPSPs)[18]。在分化培養中為了將RGC與其他類型的細胞區分開，使用一些分子標記可以將其識別出來。早期使用遺傳標記TUJ1作為RGC樣細胞的共同標記[19]，RGC表達這種標記，但不具有特異性，因為中樞神經系統中也有許多投射神經元表達此標記[20]。用于識別RGC的最常見的轉錄因子是BRN3。BRN3由視網膜內的RGC特異性表達。然而，BRN3的表達也存在于體感神經元和聽神經元中[21]。免疫熒光是一種純化RGC的技術，其利用RGC表達的表面抗原Thy-1的RGC特異性表達。使用兩步法，可以從出生后的大鼠視網膜獲得99.5%以上純度的RGC培養[22]。雖然Thy-1特異性地表達在視網膜內的RGC中，但這個標記在神經系統的許多其他類型的神經元中都有表達[23]。因此，必須注意不能僅僅依靠一個標記鑒別,而應該結合遺傳標記、形態特征和功能特征的組合表達才能鑒別RGC。目前關于RGC發育和成熟的研究發現RGC具有多樣性，在動物模型中發現和鑒定了30多種在分子、形態和生理特性上不同的亞型[24]。這些亞型表達特定的分子標記，具有不同的分子、結構和功能特征[24]。雖然在動物模型中已經觀察到大多數RGC亞型，但最近有研究在人類多能干細胞(hPSC)分化得到的RGC中也發現了不同亞型的存在[25]。這些動物研究不僅描述了這許多亞型的復雜性，還觀察了急性損傷或疾病后不同亞型的存活和再生現象[26]。接下來應該集中于如何將特定的亞型從hPSC中區分出來，以便正確理解不同視神經疾病中特定RGC亞型的退變情況，為今后在細胞替代研究和治療中解決退行性細胞丟失問題提供更多的了解。

4 視網膜移植細胞的來源

目前用于移植的各種細胞來源大致可分為成體組織來源的干細胞、胚胎來源的干細胞、祖細胞和多能干細胞。多能干細胞(PSC)目前被認為是最好的細胞來源，hPSCs可以產生視網膜再生所需的所有細胞類型[27]。2006年，TAKAHASHI等[28]發現誘導多能干細胞(iPSC)幾乎可以從人體的任何細胞中人工地制造出來，并具有與胚胎干細胞相同的功能，如無限增殖、自我更新和分化為3個胚層的能力。iPSCs可以提供自體干細胞的來源，而不需要考慮使用胚胎干細胞需要破壞胚胎的倫理問題。因此，iPSCs非常適合用于干細胞移植和體外疾病模型的建立。對于iPSC分化的過程包括2個步驟：首先細胞失去其特有的特征，呈現出一種較低分化程度的狀態；其次，細胞分化過程重新啟動，通過特定的生長因子、細胞因子和細胞外基質分子的參與，開始新的分化過程。

5 細胞移植面對的問題

5.1形成腫瘤 PSC的使用也會產生形成腫瘤的問題。未分化的iPSC可以存在于分化的細胞集落中，一同移植可能會導致畸胎瘤的形成。因此需要提高移植細胞的純度，來避免移植后畸胎瘤的形成。

5.2細胞數量 雖然各種分化方法都可以產生視網膜神經元，但這些方法中大多數仍然不能大量地產生除視桿細胞以外的特定視網膜神經元。因為體外干細胞培養方法模擬了在體內正常視網膜發育的過程，并且在小鼠和人的視網膜中，視桿細胞的數量遠遠超過RGC[29]。干細胞來源的RGC的平均產量估計為培養細胞的0.1%～30.0%，這與不同發育階段視網膜中RGC的正常比例相似。

5.3突觸形成 RGC作為視網膜的投射神經元，需要將長軸突延伸出眼睛，進入大腦并形成突觸，并正確地連接到突觸后靶點。RGC軸突受限于眼內結構的空間限制，目前沒有發現向外延伸到特定靶點的特性。

5.4免疫反應 雖然，主要組織相容性復合體(MHC)在許多類型的干細胞中的表達很低，但分化的組織表達MHC，這種表達會導致免疫排斥。即使是自體小鼠iPSC也可以誘導免疫反應，產生類似自身免疫反應。最大限度地減少手術創傷對于減少固有免疫(如自然殺傷細胞和樹突狀細胞)的激活具有重要的意義，固有免疫反過來可以激活獲得性免疫反應。

6 iPSC的應用

iPSC為研究人類視網膜退行性疾病提供了一個獨特的工具，包括青光眼等以RGC為靶點的視神經疾病。由于RGC連接眼睛和大腦之間視覺信息的傳遞，它們的退化會導致視力喪失，最終導致失明。在過去，動物模型如貓、狗、雞、豬，特別是嚙齒動物，被用來研究一些視網膜疾病相關的致病機制，使我們對疾病的許多關鍵方面有了更多了解[30]，但有時由于物種之間的差異使得在臨床環境下移植到人類身上時會失敗[31]。例如，老鼠是夜間活動的動物，它們的視網膜主要由視桿細胞組成，光感受器僅含有少量的視錐細胞(所有光感受器的3%)，這與人類視網膜存在顯著差異。并且，人類的眼睛在許多方面都是獨一無二的，例如密集斑點和三原色的組成。因此，并不是所有的疾病和藥物反應都能在動物模型中得到充分反映。iPSC衍生的RGC模型是篩選能夠改善疾病藥物高度相關的，與在動物模型上的測試相比，在臨床上具有更高的成功潛力。

以人類來源的疾病模型發展，可以產生和研究患者特有的細胞。許多基于hPSC的RGC變性的遺傳模型，例如青光眼變性在過去幾年中已經發展起來[32]，包括Six6、TANK結合激酶1(TBK1)和視神經磷酸酶(OPTN)的突變，這些都與家族性正常眼壓性青光眼(NTG)的發病有關。Six6因其在眼睛發育和形態發生中的作用而廣為人知，盡管這種轉錄因子的突變也被認為會導致NTG的發生[33]。來自Six6錯義突變患者的hPSC產生神經節細胞和視網膜細胞的效率低下，關鍵發育基因的表達減少和表達失調[34]。此外，Six6錯義突變患者RGC表現出嚴重的發育、形態和電生理缺陷，軸突生長減少，軸突引導分子表達不足。此外，Six6錯義突變的RGC表現出明顯更高的活化caspase-3水平。據推測，Six6中的這種錯義突變會導致RGC發育缺陷，這可能會使這些RGC在成年后面臨更高的退化風險。這些研究結果為開發新的視網膜退行性疾病治療方法提供了更多的思路，如果使用得當，基于PSC的視網膜模型對于深入了解許多疾病方面是有益的。

從患者來源的人iPSC生成個性化視網膜細胞也為個性化藥物治療提供了新的可能性。hPSC定向分化的RGC也為大規模的藥物篩選提供了大量細胞，然后可以特異性地針對RGC來評估化合物對疾病的療效。

7 移植手術的方式

目前考慮2種神經節細胞替代方式，即以分離的細胞懸浮液的形式移植或以預先形成的視網膜片狀移植。注射細胞懸液與片狀移植比較的優勢在于：(1)可以精確地控制細胞移植的數量；(2)供體和宿主視網膜細胞形成更好的接觸；(3)手術微創，減少術后并發癥；(4)更容易標記供體細胞。另一方面，高度退化的視網膜非常薄，并顯示出大量的膠質瘢痕，因此視網膜薄片移植所需的更復雜的手術入路可能會增加瘢痕形成和纖維化的風險。

全層視網膜薄片可以卷成套管，注入宿主視網膜的視網膜下間隙。大多數研究的主要目的是恢復光感受器功能[35]，但在此過程中也移植了RGC。然而，在貓和豬移植試驗中，幾乎沒有觀察到供體與宿主視網膜組織的整合，這表明視網膜薄片可能不是實現RGC移植的有效途徑。

目前有研究團隊沒有使用視網膜薄片進行移植，而是提純了出生后的小鼠視網膜細胞，并將它們通過玻璃體內注射的方式移植到成年嚙齒動物視網膜上[36]。實驗結果表明，從較早期(胚胎或出生后早期)分離的RGC在移植后存活率較高。盡管RGC移植的成功率很低，但一些RGC移植到宿主視網膜的玻璃體內，產生了內源性RGC的正常形態，對光有反應，甚至與外側膝狀體和視上丘建立了突觸聯系。

WANG等[37]將從胚胎干細胞(hESC)誘導分化出的視杯狀結構中提取大約20 000個RPC移植到N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)處理的小鼠玻璃體腔中。觀察發現，其中約0.5%的細胞在移植后5周成功整合到NMDA處理的小鼠視網膜中。存活的移植細胞遍布整個神經節細胞層(GCL)，與宿主殘留的RGC在小鼠視網膜GCL內呈互補分布。這些RGC投射到視神經的能力表明，hESC來源的供體細胞可能具有整合到宿主視網膜和中樞神經系統回路的能力。這些研究表明，hESC來源RGC移植是可能的，盡管效果不是很好。

8 小 結

在過去的研究中，hPSC已經被用來探究不同類型的視網膜細胞發育和各種神經退行性疾病。但大多數的研究著眼于視網膜外層細胞的疾病，利用hPSC來研究RGC疾病的試驗是缺乏的。目前運用hPSC來治療RGC疾病還存在以下幾個關鍵的問題需要解決：(1)移植細胞的手術方式選擇(以細胞懸液還是視網膜薄片)，并培養能夠掌握手術的臨床醫生；(2)從hPSC中區分出特定的亞型，正確理解不同視神經疾病中特定RGC亞型的退變情況；(3)移植細胞分化和成熟程度；(4)疾病的最佳移植時期。另外，隨著生物工程技術的發展，生物材料在移植中的運用被重視起來。一些生物相容性好的、堅固耐用的材料，如膠原、聚酯、聚環己內酯、聚酰亞胺和對苯二烯等被用來避免移植損傷和免疫反應。我們有理由相信，在不久的將來一些目前難以被治愈的視網膜神經退行性疾病在干細胞移植技術合理運用下可得到突破性的進展。